E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Özet

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

Özet

Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar ^1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme ^3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından ⁶ hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans ^7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir.

Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.

Protokol

1. Indüklenebilir Hücre Hatları Üretimi

1. İstenen bir hücre hatlarının hazırlanması için kullanılan tüm hücreleri öldüren ilaç G418 asgari konsantrasyonu bulmak için gereken deney öncesinde. Bu amaç için, deney sırasında kullanılan ve G418 artan konsantrasyonlarda (her bir ml için 0-1.000 mg) eklemek olacaktır ortam içinde konfluense% 70 az birkaç çift plaka plaka içinde tercih edilen hücreler. Etkin bir şekilde hücrelerini öldürür en az G418 konsantrasyonunu belirlemek için günlük hücreleri izler. Hücre ölümüne, 3-7 gün içinde görülmüştür.
2. Bu shRNA ifade plazmidi üzerinde çalışılan genin ekspresyonu için bir ölçüde azaltabilir geçici transfeksiyon deneylerinde tarafından doğrulanması için tavsiye edilir hücre çizgileri üretimi işleminden önce. Bu, etkin bir şekilde transfekte edilebilir herhangi bir hücre hattı içinde yapılabilir.
3. DMEM ortamı (% 10 Tet sy içeren 8 ml, 10 cm tabak başına ⁶ 5x10 etrafında bir hücre yoğunluğunda plaka T-REx-293 hücrelerikök onaylı FBS, 2mM L-glutamin, ml penisilin başına 100 birim ve ml streptomisin başına 0.1 mg, ml blasticidin başına 5 mg). 37 gece boyunca inkübe plakaları ° C,% 5 _CO2.
4. Ertesi gün, transfeksiyondan önce 8 ml taze ortam ile orta değişir.
5. Bir tetrasiklin H1-indüklenebilir promotör, hem de GFP birleşmesini ve bir kurucu PGK promotör tarafından yönlendirilen neomisin-direnç geni tarafından tahrik pSuperior.neo + GFP plasmidi (Şekil 1) kodlama ACF1 veya SNF2h shRNA 10 ug kullanılarak hücrelere transfekte. NaCl 150 mM ile 500 ul DNA ekleyin. Ug DNA başına 2 ul 150 mM NaCI ve 500 ul bir başka alikotu ile jetPIE reaktif ekleyin. DNA jetPIE çözüm ekleyin ve vorteks iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Yavaşça 70-80% konfluent hücreleri içeren 10 cm plakalar üzerine DNA kompleksleri Pipeti. Inkübatör plakaları dönün.
6. Ertesi gün olarak (bir seçici ortam ile DMEM ortamı orta değiştirmek) ml G418 başına ek 500 mikrogram içeren yukarıda tarif.
7. Önümüzdeki iki hafta hücreleri izlemek ve koloniler görünür ve bir mikroskop olmadan görsellenebilir kadar her 3-4 günde bir benzer taze ortam ile seçici besiyeri değiştirin için.
8. Kolonilerin izolasyonu önce, seçici besiyeri ile 24 kuyucuğu hazırlamak.
9. Gözle koloniler tanımlamak ve bir renkli bir işaretleyici kullanılarak plaka alt kısmında da yer işaretleyin. Koloniler de ayrıldığı mikroskop altında doğrulayın.
10. Steril kaput ise, hafifçe ılık PBS ile yıkayın ve de tüm kalan sıvı aspire, plaka orta aspire. Tripsin / EDTA plaka üzerinde tek bir koloni 0.25% 3 ul ekleyin. Hücreleri ayırmak ve 24-kuyu plaka kuyu birine eklemeniz kadar art arda tripsin pipet. Plaka üzerinde birçok koloniler için bu işlemi tekrarlayın.
11. 37 hücreleri büyümek ° C,% 5 CO ₂ kuyunun doldurana kadar. Daha sonra elde edilen hücreleri bölmeüç kuyu, ayrı bir 12-plaka her ve gece inkübe içine orijinal kolonilerin her.
12. Ertesi gün, çift damıtılmış su (her bir ml için 1-5 mg) 'de hazırlanan bir stok çözeltiden doksisiklin ml başına 1 ug ihtiva eden orta ile bir levha halinde orta değiştirin. Doksisiklin olmadan orta bir kontrol plaka orta değiştirin. 37 de 72 saat boyunca hücreler inkübe ° C,% 5 _CO2.
13. Protein ekstreleri ve ACF1 veya SNF2h devirme verimi belirlemek için Western blot analizi hazırlanması için her bir hücre klonu da tedavi uygulanan bir ikinci ve bir hücre hasat. Bir yükleme kontrol olarak hizmet veren, aynı zamanda alfa-tübülin antikorlarının olarak ACF1 veya SNF2h antikorlar kullanın. Iyi üçüncü hücreler kullanarak, doksisiklin çalışmalar devam protein düzeyinde en az% 50 azalma sağlamıştır bulunan seçilmiş hücre klonlarının genişleme için, tedavi edilmediği. Daha sonra kullanmak için% 90 FBS,% 10 DMSO içinde, bu hücrelerin alikotları dondurun.

2. Nakavt ve Transfeksiyon İndüksiyon

1. 10 cm tabaklar içinde seçici ortam içinde Levha hücreler. Yarım tabak ml başına 1 mikrogram de doksisiklin ekleyin ve 37 inkübe ° C, 48-72 saat (bkz. Şekil 4) için% 5 CO _2.
2. 48-72 saat sonra, hücreler her bir grup hücre Trypsinize saymak üzere ve aynı ortam içinde 6 cm tabak başına plaka 1.5x10 ⁶ hücreleri, birlikte ya da doksisiklin olmadan. 37 ° C'de,% 5 _CO2 gece boyunca hücreler inkübe edin. Plan çok bölüm 2.1 'dan plakaların her grup her bir nokta için DAPI tahlil için iki çiftleri yanı sıra her bir numune Western blot analizi için bir plaka (bkz. Şekil 4) içeren 6 cm oniki levhaları için hücreler sağlayacaktır.
3. Bir vektör 4 ug ile birlikte, bir 1 ug boş plazmid veya plazmid kodlama E4orf4 özdeş bir miktarı: Ertesi gün plazmid aşağıdaki kombinasyonları ile 6 cm tabaklar içinde hücreleri transfekteACF1-GFP ya da GFP-ifade eden SNF2h sessiz mutasyonlar, veya karşılık gelen boş vektör ve 1 ug plasmid GFP ifade eden (Şekil 4) 3 ug sokulması ile hücre klonları içinde shRNA karşı dirençli hale. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için yukarıda tarif edildiği gibi reaktif jetPIE (5 ug DNA başına 10 ul) kullanın. Her örnek için, üç tabak için bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.
4. Oda sıcaklığında jetPIE reaktif ile bir DNA 15 dakika inkübasyondan sonra, yavaşça üç 6 cm tabak üzerine her bir transfeksiyon karışımı DNA kompleksleri eşit miktarlarda, pipet ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 gece boyunca inkübe edilir.

3. Transfekte Hücreler DAPI Assay

1. Ertesi gün, ACF1 veya SNF2h verimli nakavt edildiğini ve E4orf4 farklı örneklerdeki eşit ifade olduğunu belirlemek için Western blot analizi için numune başına bir plaka proteinler ayıklayın.
2. DAPI yönelik plakalar orta aspiretahlil, PBS ile yavaşça plakaları yıkama ve hücreler kapak PBS içinde hazırlanmış% 4 paraformaldehid 1 ml ekleyin. Bu kimya ile hücrelerin çözelti paraformaldehit ve tedavi hazırlanması kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. Paraformaldehit ile 5 dakika aspire her zaman için oda sıcaklığında sallanan, üç kere PBS ile yıkayın. En az 1 saat boyunca -20 ° C, -20 ° C ile inkübe tutulur% 80 etanol ekleyin. Plakalar, bunlar etanol buharlaştırma ve kurutma önlemek için iyi bir sızdırmaz sürece birkaç gün boyunca -20 ° C'de etanol altında tutulabilir.
4. Etanol aspire ve PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve bir kez PBS-BT (PBS,% 0.5 BSA ve% 0.05 Tween-20 içeren) ile, her biri 5 dakika süre için oda sıcaklığında sallanan.
5. Oda sıcaklığında sallanan ise non-spesifik antikor bağlayıcı önlemek için, 20 dakika boyunca% 10 keçi serumu ihtiva eden 1 ml PBS-tampon BT hücrelerin bloke eder. Sonra t yıkayınPBS içinde iki kere BT-o hücreleri, her biri 5 dakika yıkama.
6. Oda sıcaklığında sallanan ise 1 saat boyunca 1 ml PBS-BT birincil antikor ile hücreler (bu durumda bir E4orf4-spesifik antikor) inkübe edin. Sonra, PBS-BT içinde iki kere yıkayın ve bir defa PBS içinde% 0.1 BSA, 5 dak, her yıkama içeren.
7. Karanlıkta oda sıcaklığında, 40 dakika sallama süre için uygun ikincil floresan-etiketli antikor ve DAPI ml nihai konsantrasyon başına 0.5 ug içeren PBS-% 0.1 BSA, 1 ml hücre inkübe edin. Ardından 5 dakika süreyle PBS ile yıkayın aspirasyonu ile iyice kurumasını ve tam kurumanın elde etmek gecede ek bir saat baş aşağı plakaları tutmak. Daha sonra Fluoromount-G çözeltisi kullanarak, hücreler üzerine kapak slaytlar monte edilebilir. 4 at tabak tutun ° C karanlıkta apoptotik çekirdekler saymak için hazır olana kadar.
8. Tarafsız bir şekilde yapılabilir böylece çeşitli örneklerde apoptotik nükleus sayma, yeni numaralar tarafından çeşitli levhalar tanımlamak için bir meslektaşım değildir.
9. Bir u altında hücreler görselleştirmek400X (hava) veya 630X (immersiyon yağı olarak) bir büyütme pright floresan mikroskop. Her örnek ifade çeşitli proteinler için lekeli ve transfekte hücre popülasyonu içindeki DAPI boyanarak gözlemlenmiştir özet ya da parçalanmış çekirdeklerin sayısını edilir transfekte hücreler tanımlayın. Birkaç alanları izlemek ve en az 200 transfekte hücreler toplam saymak.
10. Transfekte hücre popülasyonu içindeki apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin yüzdesini hesaplayın. Çiftleri ile, deney tekrarlayın 2-3 kez, çeşitli örnekler arasındaki değişikliklerin istatistiksel anlamlılık hesaplamak için.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Gen ekspresyonunun şartlı devirme başarılı olmuştur ki içinde elde kolonilerin verim ilgili gen bağlı olarak değişir. Bizim eller, biz SNF2h için ACF1 ve 18 takım arasından 6 için test 12 üzerinden 7 başarılı koloniler elde edilmiştir. Şekil 2 shSeçilen hücre klonu (Şekil 2A) ve aynı zamanda, tek bir koloni (Şekil 2B) temsili bir plaka ows. Şekil 3, 72 saat için doksisiklin varlığı ya da yokluğu içinde yetiştirilen hücreler çeşitli klonlar elde edilen proteinler ile hazırlanmış bir temsilci blot göstermektedir. Blot bir yükleme kontrol olarak görev SNF2h ve alfa-tubulin antikorları ile boyandı. İki klon (sayısı 4 ve 5) doksisiklin indüksiyon üzerine SNF2h seviyelerinde güçlü bir azalma gösterdi. Şunu belirtmek gerekir ki, her ne kadar pSuperior.neo hücre hatları, neo-GFP füzyon proteinini kodlayan üretimi için kullanılan plazmid + GFP (Şekil 1), stabil hücre hatları da yeşil floresan çok düşük olduğu ve diğer GFP füzyon proteinlerinin ekspresyonu bu hücrelerin içine geçici olarak tanıttı kolayca arkaplanı yeşil floresans yukarıda tespit edilebilmiştir.

Deneylerin şematik mea için hücre klonları içinde yürütülenemin ACF1 veya E4orf4 ile indüklenen hücre ölümü üzerindeki SNF2h devirme etkisi Şek. 4. Doksisiklin muamele ile gen ekspresyonu demonte için gereken zaman düzeyleri azaltılması gerekir proteinin stabilitesi bağlı olarak değişebilir. ACF1 ve SNF2h için, 72 saat tedavi protein düzeyinde etkin demonte için gerekli oldu.

Şekil 5, E4orf4 ve GFP ifade eden ve bir sıkıştırılmış ya da morfolojisi ile parçalanmış DAPI-lekeli çekirdekleri ortaya çıkması ile kendini gösteren hücre ölümü geçiren hücrelerin bir örneği gösterilmiştir. Şekil 6, doksisiklin ile endüklenen ACF1 portatif bir yol olduğunu gösteren bir temsili deneyin sonuçlarını gösterir E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü (Şekil 6A) bir artış görülmektedir. Bu artış E4orf4 düzeyleri (Şekil 6B) bir artış sonucu vermedi. Ayrıca, doksisiklin ile endüklenen hücrelerin ACF1 restorasyon seviyeleri E4orf4 toksisitesinde artışa azaldığı uninduced hücreleri (Şekil 6) gözlendi.

Şekil 1. Plazmid pSuperior.neo + GFP haritası. Haritası shRNA ifade ve neo-GFP füzyon proteini PGK organizatörü sürüş ifade sürüş tetrasiklin indüklenebilir H1 organizatörü gösterir. Haritayı OligoEngine pSuperior manuel uyarlanmıştır.

Şekil 2. Bir plaka neomisin dirençli kolonilerin tanımlanması. Görüntü koloniler (A) ihtiva eden ve bir tek koloni (B) gösterilmektedir. Koloniler neomisin içeren bir seçici ortam içinde kültürlenmesi ile 14 gün için hücreler elde edildi.

ys ">
Şekil 3,. Neomisin varlığında seçilmiş çeşitli koloniler seçilmiş koloniler halinde devirme verim incelenmesi. Hücreler çift kuyu içinde ekildi. Her bir numunenin iyi bir doksisiklin (+) ile indüklendi ve bir de edilmiş ve trete edilmemiştir (-). Proteinler, 72 saat sonrası indüksiyon ekstre edilmiş ve SDS-PAGE üzerinde kromatograflanmıştır. Western Blot SNF2h ve alfa-tubulin (bir yükleme kontrol olarak görev) karşı antikorlar ile ardarda lekeli ve isteyerek ve kontrol hücrelerinde SNF2h seviyelerini gösterir oldu.

Şekil 4. Tipik knockdown-DAPI tahlil denemenizi planlama. Deney Ardışık adımları ACF1 veya SNF2h demonte, ACF1 veya SNF2h ifadeyi geri veya bir emp tanıtmak için bir transfeksiyon ulaşmak için doksisiklin tedavisi de dahil olmak üzere, gösterilirty vektör ve hücre içine E4orf4 ya karşılık gelen boş bir vektör tanıtmak ve sonuçların analizi. Doksisiklin ile tedavi edilen plakalar kırmızı renkle gösterilmiştir (Dox) ve kontrol plakaları mavi renkle işaretlenmiştir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Şekil 4'te gösterildiği üzere çeşitli tedavi uygulandı DAPI tahlil ile E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü saptanması. Hücreler sabit ve Transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerinin görselleştirmek için E4orf4-spesifik antikorlar ve DAPI ile boyandı. Bu, belirli bir resim, bir örnek içeren E4orf4 ve kontrol GFP protein alınmıştır. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Birleştirilmiş görüntü. Beyaz oklar işareti GFP ve apoptotik morfolojileri ile çekirdekler içeren E4orf4 transfekte hücreler. Kırmızı oklarapoptotik çekirdekler olarak sayılmaz düzensiz şekillere sahip çekirdekler işaretleyebilirsiniz. Sadece bölünmüş Asteriskler işareti mitotik çekirdekleri veya çekirdekler.

Şekil 6. ACF1 devirme E4orf4 ile uyarılan hücre ölümünü artırır. (A), bir tetrasiklin indüklenebilir promotör dan ACF1-shRNA eksprese eden T-Rex-293-türevi hücre hattı hücreleri doksisiklin (+ Dox) ya da sol tedavi edilmemiş (-Dox) ile oluşturuldu. Üç gün sonra, hücreler plazmid sessiz girişiyle shRNA dayanıklı hale getirildi boş bir vektör veya GFP etiketli ifade plazmid ACF1, birlikte E4orf4 (+ E4orf4) veya boş bir vektör (-E4orf4) ifade ile transfekte edildi mutasyonlar. Hücreleri yirmi dört saat E4orf4 antikorları ile transfeksiyon ve lekeli sonra ve DAPI ile tespit edildi. Hücre ölümü Asenkron yukarıda tarif edilen yöntemi ve DAPI yüzdesi o ile ölçüldüözet ya da parçalanmış nükleuslu f transfekte hücreler tespit edildi. Üç temsilcisi deney gösterilir çoğaltır ve hata çubukları standart sapma temsil eder. (B) paralel plaka hücreleri Western blot analizi için hasat edildi. Leke E4orf4, GFP ve ACF1 antikorları ile boyandı. Endojen ACF1 ve ACF1-GFP iki ayrı panel gösterilmiştir.

Tartışmalar

Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA'lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Yüksek glukoz DMEM	Gibco	41965
Tet sistemi onaylı FBS	Clontech	631106
L-glutamin	Gibco	25030
Kalem Strep	Gibco	15140
% 0.25 tripsin-EDTA	Gibco	25200
T-Rex-293 hücreleri	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticidin	InvitRogen'a	R210-01
plazmid pSuperior.neo + GFP	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfeksiyon	101-40
doksisiklin	Sigma	D9891
paraformaldehid	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01