الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Summary

الوشم الجلد هو وسيلة فعالة وآمنة لقاح الحمض النووي تسليم intradermally. هنا، يتم تسليم EGFP DNA البلازميد الترميز عن طريق الوشم على الجلد على فأرة الحاسوب المختبر، ويتم تفتيش ثم التعبير عن EGFP في خلايا الجلد عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

Abstract

الحمض النووي القائم على التطعيم هو موضوع اهتمام متزايد، وخاصة DNA البلازميد (PDNA) ترميز المستضدات المناعية الهامة. بعد إدارة PDNA هندسيا للقاحات، هو كتب وترجم إلى البروتينات التي يمكن أن مستمنع الحصول على ردود من الجهاز المناعي. وقد تم التحقيق في العديد من الطرق لإيصال اللقاحات DNA، ولكن كل طريق تسليم مزاياه الخاصة والمزالق. الوشم الجلد هو أسلوب الرواية التي هي آمنة، فعالة من حيث التكلفة، ومريحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للثقوب من جراء إبرة بمثابة مساعد قوية. هنا، ونحن أ) إثبات الدفع من داخل الأدمة ترميز الحمض النووي البلازميد تعزيز الفلورسنت الأخضر البروتين (PCX-EGFP) في نموذج الفأر باستخدام جهاز الوشم وب) تأكيد التعبير الفعال للEGFP في خلايا الجلد باستخدام المجهر متحد البؤر.

Protocol

1. بلازميد الحمض النووي تنقية

1. تحويل البلازميد DNA حقيقية النواة ترميز EGFP (PCX-EGFP) في الخلايا القولونية DH5α المختصة. ويمكن أيضا للناقلات الفارغة PCX استخدامها كعنصر تحكم سلبية.
2. الثقافة وحصاد الخلايا القولونية DH5α وتنقية PDNA وفقا لكتيب EndoFree QIAGEN تنقية البلازميد.
3. مرشح PDNA حل من خلال 0،22 ميكرون تصفية العقيمة PVDF، وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. الوشم نظام إعداد

1. توصيل الوحدة المحمولة ودواسة التحكم إلى وحدة التزويد بالطاقة في إرشادات الشركة المصنعة.
2. تعيين تيرة التذبذب الإبرة إلى ما يقرب من 100 هرتز. للجهاز الوشم اخترنا (نظام الشبح الوشم الروتاري)، يجب تعيين الطلب على إمدادات الطاقة إلى 4 فولت. الرجوع إلى دليل المستخدم أو الدعم الفني لأنظمة الوشم الأخرى.
3. تعقيم الإبرة عراي قبل الاستخدام. نوصي باستخدام أحد مجموعة إبرة لكل حيوان. يمكن إعادة استخدامها الإبر بعد تطهيرها بالماء والصابون وتعقيمها.
4. تثبيت مجموعة إبرة في يده وحدة وإرفاق فضفاضة قبضة بلاستيكية.
5. ضبط عمق الإبرة إلى الإعداد المناسب عن طريق نقل قبضة بلاستيكية أعلى أو لأسفل. كنا على عمق الإبرة حوالي 0.5 مم لدينا تجربة الماوس.
6. تشديد قبضة بلاستيكية عندما يتم تعيين بشكل صحيح عمق الإبرة، ونظام الوشم هو جاهز للاستخدام.

3. حلاقة الحيوان

1. اختيار موقع لعلاج الوشم. يجب أن يكون الموقع في منطقة شركة نسبيا، شقة، وحمي من الجلد، على سبيل المثال، إلى جانب hindleg الحيوان.
2. تخدير ماوس BALB / ج مع خليط من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ) وفقا لوزن جسم الحيوان. لحيوانات أخرى، الرجوع إلى المبادئ التوجيهية التخدير من مؤسستكم.
3. تحقق منردود الفعل من قبل الحيوان معسر قدم لها للتأكد من الحيوان للتخدير بشكل صحيح.
4. استخدام الانتهازي الكهربائية لخفض الشعر في hindlegs الحيوان ببطء وحذر. إزالة الشعر من موقع المخطط والوشم والمنطقة المحيطة بها.
5. إزالة الشعر أقصر المتبقية مع الحلاقة سلامة التخلص منها. يجب الحرص على عدم قطع الجلد الحيوان. ملاحظة التي يمكن أن تستخدم كريم مزيل الشعر كطريقة بديلة إزالة الشعر، ولكن، ونحن نفضل كريم الحلاقة على مزيل الشعر.
6. إزالة الشعر طائشة قطع من الجلد مع الهواء المضغوط إذا لزم الأمر.

4. تسليم DNA البلازميد بواسطة الوشم

1. إذا كان قد تم إنشاء بروتوكول التحصين سابقا، ينبغي أن تحسب الجرعة وحجم حل DNA ليتم تطبيقها وفقا لذلك. نوصي باستخدام وحجم صغير ممكن عمليا لجعل عملية الوشم أكثر قابلية للإدارة. في هذه المظاهرة EGFP، استخدمنا 7،5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في يخدعوحدانية من 0.25 ملغ / مل، والتي تم تطبيقها على منطقة الوشم من حوالي 1 سم ^2. التحصين للتجارب، قد يكون مطلوبا تركيزات أعلى PDNA للحث على الاستجابات المناعية قوية ^1،2.
2. تطبيق حل DNA من قبل pipetting مباشرة على موقع الوشم. بدلا من ذلك، تحميل حل DNA في قبضة بلاستيكية بواسطة pipetting، لذلك تم تعليق السائل بين الإبرة وغيض من قبضة بلاستيكية. الرجوع إلى الفيديو لمظاهرة. وقد لاحظنا يوجد فرق ملحوظ بين الطريقتين. ومع ذلك، قد حل في تحميل قبضة بلاستيكية يكون من المفيد على السطوح العمودية الجلد، على سبيل المثال.
3. بدء التذبذب الإبرة ووضع مجموعة الإبرة مع الضغط الخفيف على جلد الحيوان في موقع الوشم. ثم نقل إبرة تتأرجح بلطف وببطء بطريقة خطية لإيصال الحمض النووي البلازميد فوق منطقة الوشم بالكامل. الحفاظ على زاوية 90 درجة بين الإبرة والجلد لتجنبجروح على الجلد.
4. مراقبة الجلد. الكشط والتهاب طبيعية. إذا كان النزيف يحدث، ووقف عملية الوشم وتقلل من عمق الإبرة.
5. تواصل حركة إبرة لحوالي 1 دقيقة، ثم إيقاف عملية الوشم.
6. استخدام مسحة قطنية نظيفة لتطبيق طبقة رقيقة من مسكن موضعي على موقع الوشم. يمكن المسكنات الموضعية مثل كريم سلفاديازين الفضة (SSD كريم) أو مرهم Neosporin تساعد على التخفيف من الألم أو الضيق من الحيوانات، وبالتالي ينصح تطبيقها قبل التخدير يلبس. مراقبة الحيوانات في اليوم التالي بحثا عن علامات على الألم أو الضيق (تغيير من الخمول والمشية). تطبيق كريم مسكن إذا علامات لا تزال قائمة.

5. تأكيد التعبير مستضد

1. 48 ساعة بعد العلاج الوشم (لاحظ أن يبني PDNA مختلفة قد تتطلب أوقات مختلفة التعبير)، والموت الرحيم الماوس من الخدر ₂ CO. لأخرىالحيوانات، تشير إلى المبادئ التوجيهية القتل الرحيم من مؤسسة الخاصة بك.
2. تشريح الجلد في موقع الوشم، وإصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
3. شطف الأنسجة مع الايثانول 70٪، وتحويلها إلى PBS 1X للتصوير.
4. دراسة الأنسجة كله باستخدام مجهر مبائر للتحقق من الإشارات EGFP. بدلا من ذلك، تكون جزءا لا يتجزأ من نسيج الجلد في شمع البارافين ودرست في أقسام تحت المجهر الفلورسنت.

النتائج

ويمكن ملاحظة التعبير عن EGFP مع ذروة الإثارة في 488 نانومتر والتي تبلغ 509 ذروة الانبعاثات نانومتر في خلايا الجلد الماوس. من جرعة ميكروغرام من الحمض النووي 1،875، تحتوي على ما يقرب من 3 × 10 ¹⁷ نسخ من البلازميد، لاحظنا عادة إشارات EGFP 10-20 سم في 1 ² وشم المنطقة. هذا العد?...

Discussion

ويعتبر التطعيم DNA أكثر أمانا من استراتيجيات التطعيم التقليدية لأنها لا تتطلب التلاعب، أو فضح لقاحات ومسببات الأمراض الموهنة الحية أو ^4. ومع ذلك، ونتيجة للتطعيم DNA يعتمد اعتمادا كبيرا على طريق التسليم. الجلد هو وفرة في الخلايا مستضد تقديم مثل خلايا لانغرهانس وال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / المواد	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
PCX-DNA البلازميد EGFP	Clontech
نظام STEALTH الوشم الروتاري	في جميع أنحاء العالم الوشم التموين	STEALTH-L
الوشم والإبر	في جميع أنحاء العالم الوشم التموين	1207RSB
EndoFree كيت ماكسي البلازميد	QIAGEN	12362
0،22 ميكرون تصفية العقيمة PVDF	ميليبور	SLGV013SL
الشعر الانتهازي الكهربائية	المتاحة تجاريا
يمكن التخلص منها سلامة شفرات الحلاقة	المتاحة تجاريا
فضةسلفاديازين كريم	واتسون	NDC 0591-0810-55
الكيتامين HCL		NDC 0856-2012-01
محلول معقم Zylazine		NADA 139-236