Haut Tätowieren als einen neuartigen Ansatz für DNA Vaccine Lieferung

Zusammenfassung

Haut Tätowieren ist ein potenter und sicheren Weg zur Auslieferung DNA-Impfstoff intradermal. Hier wird ein DNA-Plasmid kodiert EGFP durch Tätowierung auf der Haut eines Labormaus geliefert, und die Expression von EGFP in den Hautzellen wird dann durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Zusammenfassung

Nukleinsäure-basierte Impfungen ist ein Thema von wachsendem Interesse, insbesondere Plasmid-DNA (pDNA) Codieren immunologisch wichtigen Antigenen. Nachdem sich das manipulierte pDNA den Impfstoffen verabreicht wird, wird es transkribiert und übersetzt in Immunogen Proteine, die Antworten des Immunsystems auslösen kann. Viele Wege zur Umsetzung der DNA-Impfstoffe untersucht worden, aber jede Lieferung Strecke hat seine eigenen Vorteile und Fallstricke. Haut Tätowieren ist eine neuartige Technik, die sicher, kostengünstig und bequem ist. Darüber hinaus könnten die Einstiche von der Nadel zugefügt auch als potente Adjuvans dienen. Hier haben wir a) zeigen die intradermalen Verabreichen von Plasmid DNA, die verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP pCX-) in einem Maus-Modell unter Verwendung eines Geräts Tätowieren und b) bestätigen die effektive Expression von EGFP in den Hautzellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Protokoll

Ein. Plasmid DNA Purification

1. Wandeln Sie die eukaryontischen Plasmid DNA, EGFP (pCX-EGFP) in DH5 E.coli kompetenten Zellen. Der leere pCX Vektor kann auch als negative Kontrolle verwendet werden.
2. Kultur und Ernte die DH5a E.coli Zellen und reinigen die pDNA nach dem Qiagen EndoFree Plasmid Purification Handbook.
3. Filter pDNA Lösung durch einen 0,22 um PVDF Sterilfilter, und speichern Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung.

2. Tattoo System Preparation

1. Schließen Sie das Handheld-Einheit und die Kontrolle Pedal Netzteil pro Anweisungen des Herstellers.
2. Die Nadel Schwingungsfrequenz auf etwa 100 Hz. Für die Tätowierung Gerät, das wir wählten (Stealth Rotary Tattoo System), sollte das Rad an der Stromversorgung bis 4 Volt eingestellt werden. Siehe Bedienungsanleitungen oder technische Unterstützung für andere Tätowierung Systeme.
3. Sterilisieren der Nadel array vor Gebrauch. Wir empfehlen die Verwendung einer Nadel array pro Tier. Die Nadeln können, nachdem sie mit Seifenwasser gereinigt und autoklaviert wiederverwendet werden.
4. Installieren Sie die Nadel Array in der tragbaren Einheit und lose befestigen Sie den Kunststoffgriff.
5. Passen Sie die Nadel Tiefe eine entsprechende Einstellung, indem Sie den Kunststoffgriff oben oder unten. Wir verwendeten eine Nadel Tiefe von etwa 0,5 mm für unseren Maus-Experiment.
6. Ziehen Sie die Kunststoff-Griff, wenn die Nadel Tiefe richtig eingestellt ist, und die Tätowierung System ist bereit für den Einsatz.

3. Tierische Shaving

1. Wählen Sie den Standort für das Tätowieren Behandlung. Der Standort sollte eine relativ feste, flache und fleischige Bereich der Haut, zum Beispiel die Seite des Tieres Hinterbein sein.
2. Anästhesieren einer Balb / c-Maus mit einer Mischung aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg) nach dem Körper des Tieres beträgt. Für andere Tiere, die Anästhesie Richtlinien Ihrer Einrichtung beziehen.
3. Überprüfen Sie dieTier Reflexe durch Kneifen seinen Fuß, um das Tier zu bestätigen ist richtig betäubt.
4. Verwenden Sie die elektrische Trimmer trimmen sich die Haare des Tieres Hinterhand langsam und vorsichtig. Entfernen Sie die Haare aus dem geplanten Tätowierung Ort und die Umgebung.
5. Entfernen Sie die verbleibende kürzere Haare mit dem Einweg-Rasierapparat. Achten Sie darauf, die Haut des Tieres geschnitten. Beachten Sie, dass Enthaarungscreme als Alternative Haarentfernung Verfahren verwendet werden kann, aber wir lieber über Enthaarungscreme Rasur.
6. Entfernen streunenden geschnittenen Haare aus der Haut mit Druckluft, wenn nötig.

4. Lieferung von Plasmid-DNA durch Tätowierung

1. Wenn ein Immunisierungsprotokoll zuvor festgestellt worden, sollte die Dosis und das Volumen der DNA-Lösung aufgebracht werden entsprechend berechnet werden. Wir empfehlen die Verwendung als kleines Volumen als praktische, um die Tätowierung Prozess mehr überschaubar. In diesem EGFP Demonstration, verwendeten wir 7,5 &mgr; l DNA-Lösung bei einer conzentration von 0,25 mg / ml, die auf ein Tätowieren Fläche von ca. 1 cm ² aufgebracht wurde. Für die Immunisierung Experimente können höhere Konzentrationen erforderlich pDNA starke Immunantworten ^1,2 induzieren.
2. Übernehmen Sie die DNA-Lösung mit einer Pipette direkt auf die Tätowierung Website. Alternativ laden die DNA-Lösung in den Kunststoffgriff durch Pipettieren, so wird die Flüssigkeit zwischen der Nadel und der Spitze der Kunststoffgriff suspendiert. Siehe das Video für eine Demonstration. Wir haben keine merkliche Differenz zwischen den zwei Verfahren beobachtet. Allerdings kann das Laden der Lösung in den Kunststoffgriff werden auf vertikalen Hautflächen vorteilhaft, zum Beispiel.
3. Starten Sie die Nadel Schwingung und die Nadel Array mit leichtem Druck auf die Haut des Tieres an der Tätowierung Website. Dann bewegen Sie den oszillierenden Nadel vorsichtig und langsam in einer linearen Weise, Plasmid-DNA über die gesamte Tätowierung Bereich liefern. Aufrechterhaltung eines 90-Grad-Winkel zwischen der Nadel und der Haut zu vermeiden,Schnittwunden auf der Haut.
4. Beachten Sie die Haut. Abrasion und Entzündungen sind normal. Wenn die Blutung auftritt, halten Sie die Tätowierung Prozess und verringern die Nadel Tiefe.
5. Fahren Sie mit der Nadel Bewegung für ca. 1 min, und dann stoppen die Tätowierung Prozess.
6. Verwenden Sie ein sauberes Wattestäbchen, um eine dünne Schicht aktuelles Analgetikum auf dem Tätowieren Website gelten. Topical Analgetika wie Silbersulfadiazin-Creme (SSD Cream) oder Neosporin Salbe kann Linderung der Schmerzen oder Leiden der Tiere, und deshalb ist es ratsam, sie anzuwenden, bevor die Betäubung nachlässt. Beobachten Sie die Tiere am nächsten Tag auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden (Änderung der Gangart, Inaktivität). Wenden schmerzstillende Creme, wenn die Zeichen anhalten.

5. Bestätigung der Antigen Expression

1. 48 Stunden nach dem Tätowieren Behandlung (beachten Sie, dass verschiedene pDNA Konstrukte können unterschiedliche Expression Zeiten erfordern), wird die Maus durch CO ₂ Narkose getötet. Für andereTiere, die Euthanasie Richtlinien Ihrer Einrichtung beziehen.
2. Sezieren die Haut an der Tätowierung Website, und befestigen Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C über Nacht.
3. Spülen des Gewebes mit 70% Ethanol, und gibt sie in 1X PBS zur Bildgebung.
4. Untersuchen Sie das ganze Gewebe mit einem konfokalen Mikroskop für EGFP-Signale überprüfen. Alternativ kann das Hautgewebe in Paraffinwachs eingebettet und untersucht werden abschnittsweise unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Die Expression von EGFP mit einem Anregungsfilter Peak bei 488 nm und Emissionspeak bei 509 nm kann in Hautzellen von Mäusen beobachtet werden. Aus einer 1,875 ug Dosis von DNA, die etwa 3 × 10 ¹⁷ Kopien des Plasmids, wir typischerweise beobachtet 10-20 EGFP Signale in den 1 cm ² tätowierten Bereich. Diese relativ geringe Anzahl von transfizierten Zellen ist konsistent mit den Ergebnissen einer früheren Studie ^3. Das EGFP-Expression (Abbildung 1) liefert den Beweis, ...

Diskussion

DNA-Impfung gilt als sicherer als herkömmliche Impfstrategien, da sie nicht verlangen, Manipulation oder aussetzen Impfstoffe, live oder abgeschwächte Erreger ^4. Jedoch hängt das Ergebnis der DNA-Vakzinierung stark von der Lieferroute. Haut ist reichlich in Antigen-präsentierende Zellen, wie Langerhans-Zellen und dendritischen Zellen ¹ und damit eine ideale Ort für die Immunisierung im Hinblick auf Immunogenität und leichte Zugänglichkeit ^5,6. Als Ergebnis ist intradermale Impfstr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
pCX-EGFP-Plasmid-DNA	Clontech
STEALTH Rotary Tattoo-System	Weltweit Tattoo Supply	STEALTH-L
Tattoo Nadeln	Weltweit Tattoo Supply	1207RSB
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
0,22 um PVDF Sterilfilter	Millipore	SLGV013SL
elektrischen Haarschneider	Kommerziell erhältliche
Einweg-Rasierapparate	Kommerziell erhältliche
SilberSulfadiazin-Creme	Watson	NDC 0591-0810-55
Ketamin HCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine sterilen Lösung		NADA 139-236