皮肤纹身作为一种新的方法DNA疫苗交货

摘要

皮肤纹身是一个强大的和安全的方式来传递DNA疫苗皮内。在这里，一个DNA质粒EGFP交付纹身实验室小鼠的皮肤，和EGFP在皮肤细胞中的表达，然后通过激光共聚焦显微镜检查。

摘要

基于核酸的疫苗接种是一个主题的日益增长的兴趣，特别是质粒DNA（pDNA的）编码免疫学上重要的抗原。工程质粒DNA疫苗给药后，它被转录和翻译成免疫原的蛋白质，可以从免疫系统引起的反应。提供DNA疫苗的方法很多被调查，但每次送货路线都有自己的优点和缺陷。皮肤纹身是一种新的技术是安全的，符合成本效益，方便的。此外，穿刺针造成，也可以作为一种有效的佐剂。在这里，我们a）表现出增强型绿色荧光蛋白的质粒DNA编码的皮内交付（PCX-EGFP）在小鼠模​​型中，使用纹身的移动设备和b）在皮肤细胞中，使用共聚焦显微镜，确认有效的EGFP表达。

研究方案

1。质粒DNA纯化

1. 变换到DH5α 大肠杆菌感受态细胞的真核质粒DNA编码EGFP（PCX-EGFP）。空PCX载体也可以使用作为阴性对照。
2. 文化和收获DH5α 大肠杆菌细胞和纯化的质粒DNA根据到的Qiagen公司EndoFree的质粒纯化手册"。
3. 筛选pDNA的溶液通过0.22μm的PVDF无菌过滤器，并将其储存在-20℃直到使用。

2。纹身系统准备

1. 手持式单元和控制踏板连接到电源单元，按照制造商的说明书。
2. 设置针的振荡频率约为100赫兹。我们选择了纹身的设备（隐形旋转纹身系统），表盘上的电源应设置为4伏。请参阅用户手册或其他纹身系统的技术支持。
3. 消毒针头AR使用光前。我们建议您使用一个针阵列的每个动物。用肥皂水清洗和高压灭菌后可重复使用的针。
4. 针阵列安装到手持设备和松散连接的塑料把手。
5. 针深度调整到一个适当的设置，通过向上或向下移动的塑料的抓地力。我们使用我们的小鼠实验深度大约为0.5毫米的针。
6. 正确设置时，进针深度，拧紧塑料把手和纹身系统是可以使用的。

3。动物剃毛

1. 选择网站纹身的治疗。该网站应该是一个相对稳固，平坦的，和肉质部位的皮肤，例如，动物的后腿侧。
2. 与氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（5毫克/公斤），根据动物的体重的混合物麻醉的BALB / c小鼠。对于其他动物，请参阅您的机构的麻醉指引。
3. 检查动物的反射，按捏它的脚，以确认动物是适当的麻醉。
4. 使用电剪修剪下来的头发，动物的后肢慢慢地，仔细地。从计划的纹身现场及周边地区的去除毛发。
5. 去除残留的短发的一次性使用的安全剃须刀。注意不要剪动物的皮肤。需要注意的是，可以使用脱毛膏脱毛作为一种替代方法;然而，我们宁愿剃须超过脱毛膏。
6. 删除杂散切下的毛发从皮肤如有必要，用压缩空气。

4。质粒DNA的纹身交货

1. 如果先前已建立的免疫协议，剂量和要应用的DNA溶液的体积应据此计算。我们建议您使用尽可能小的体积为实际使纹身的过程中更易于管理。在这EGFP示范，我们使用7.5μlDNA溶液在CON对中的0.25毫克/毫升，施加到一个纹身面积约1厘米^2。用于免疫的实验中，更高的质粒DNA浓度可能需要诱导强烈的免疫反应^1,2。
2. 纹身的网站上移液直接应用DNA解决方案。可替换地，加载到塑料把手的DNA溶液通过移液，因此针和塑料把手的前端之间的液体悬浮。一个用于演示的视频。我们已观察到的两种方法之间没有明显的区别。然而，加载溶液倒入塑料把手可能是有利的垂直的皮肤表面上，例如。
3. 启动针振荡和放置针阵列与动物的皮肤纹身的站点上的压力的光。然后将振荡针轻轻地，慢慢地以线性方式提供质粒DNA在整个纹身区。维持一个90度角之间的针和皮肤上，以免皮肤割伤。
4. 观察皮肤。磨损和炎症是正常的。如果出血情况时，停止纹身的过程中，减少进针深度。
5. 继续针运动约1分钟，然后停止纹身的过程。
6. 用干净的棉签涂抹一层薄薄的局部止痛纹身的网站上。如磺胺嘧啶银乳膏（SSD霜）或抗生素软膏软膏外用止痛药可以帮助减轻疼痛或痛苦的动物，因此建议申请前的麻醉消退。第二天观察动物的疼痛或痛苦的步态变化，缺乏运动的迹象。如果仍然存在的迹象，重新应用止痛膏。

5。确认抗原的表达

1. 纹身的治疗后48小时内（注意，不同的质粒DNA结构可能需要不同的表达时间），鼠标CO ₂麻醉安乐死。对于其他动物安乐死的指引，你的机构。
2. 剖析在纹身的部位，并修复皮肤组织4％多聚甲醛4℃过夜。
3. 用70％乙醇冲洗组织，并将其转移到的1X PBS中，用于成像。
4. 检查整个组织使用激光共聚焦显微镜检查EGFP信号。另外，皮肤组织可以被嵌入在石蜡中，并在荧光显微镜下检查节。

结果

在小鼠皮肤细胞中可以观察到在488nm和发射峰在509 nm处的激发峰的EGFP的表达。从1.875μg剂量的DNA，含有约3×10 ^17个拷贝的质粒，我们通常观察到10-20的EGFP信号在1厘米²纹身面积。这种相对较低的转染细胞的数量是先前的研究³的结果相一致。 EGFP表达（ 图1）提供的证据表明，EGFP质粒被输送到动物的皮肤细胞，使用的DNA纹身技术。

讨论

DNA疫苗比传统的疫苗接种策略，被认为是更安全，因为它不要求操作，或暴露疫苗，活的或减毒的病原体。然而，DNA疫苗接种的结果，在很大程度上依赖于配送路线。皮肤是丰富的抗原呈递细胞，如朗格汉斯细胞和树突状细胞^1，从而在一个理想的站点用于免疫的免疫原性和易于访问^5,6。其结果是，皮内接种策略是用于DNA疫苗的最流行的选择之一。在这个视频中，DNA纹身是一个简?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
PCX-EGFP质粒DNA	Clontech公司
STEALTH旋转纹身系统	全球纹身器材	STEALTH-L
纹身针	全球纹身器材	1207RSB
EndoFree质粒试剂盒	Qiagen公司	12362
0.22微米PVDF无菌过滤器	密理博	SLGV013SL
电发剪	市售
一次性使用的安全剃须刀	市售
银磺胺嘧啶霜	沃森	NDC 0591-0810-55
氯胺酮HCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine无菌溶液		NADA 139-236