Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Резюме

Кожа татуировка является эффективным и безопасным способом доставки ДНК-вакцины внутрикожно. Здесь, ДНК плазмиды EGFP кодирования поставляется татуировки на коже лабораторных мышей, и выражение EGFP в клетках кожи, затем проверку с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

На основе нуклеиновой кислоты вакцинации тему растущий интерес, особенно плазмидной ДНК (плазмидной ДНК), кодирующей иммунологически важных антигенов. После инженерных пДНК вводят вакцины, она расшифрованы и переведены на иммуноген белки, которые могут получить ответы от иммунной системы. Много способов доставки ДНК-вакцин были исследованы, однако каждый маршрут доставки имеет свои преимущества и недостатки. Кожа татуировки новую технику, которая является безопасной, экономически эффективной и удобной. Кроме того, нанесенный проколов иглой может также служить мощным адъюванта. Здесь мы) показывают, внутрикожные доставки плазмидной ДНК, кодирующей расширения зеленого флуоресцентного белка (PCX-EGFP) в мышиной модели с помощью татуировки устройств и б) подтвердить эффективное выражение EGFP в клетках кожи с помощью конфокальной микроскопии.

протокол

1. Очистка ДНК плазмиды

1. Преобразование эукариотической плазмиды ДНК, кодирующей EGFP (PCX-EGFP) в DH5α компетентных клеток E.coli. Пустой вектор PCX также могут быть использованы в качестве отрицательного контроля.
2. Культура и урожай DH5α клеток E.coli и очищают пДНК в соответствии с Qiagen EndoFree плазмиды Справочник очистки.
3. Фильтр пДНК раствор через 0,22 мкм ПВДФ стерильный фильтр, и хранить его при температуре от -20 ° C до использования.

2. Татуировка Система подготовки

1. Подключите портативный блок и педали к блоку питания в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
2. Установите частоту колебаний иглы примерно до 100 Гц. Для татуировки устройства мы выбрали (Stealth Роторная система Tattoo), циферблат на блоке питания должно быть установлено до 4 вольт. См. руководство пользователя или технической поддержки для других систем татуировки.
3. Стерилизовать иглы арлуча перед использованием. Мы рекомендуем использовать одну иглу массив на одно животное. Иглы могут быть повторно использованы после того, как очищается водой с мылом и в автоклаве.
4. Установите иглу массива в РПУ и свободно закрепить пластиковые рукоятки.
5. Отрегулируйте иглу глубину соответствующие настройки, перемещая пластиковой рукояткой вверх или вниз. Мы использовали иглы глубину около 0,5 мм для нашего эксперимента мыши.
6. Затянуть пластиковые рукоятки, когда игла глубину правильно настроен, и татуировка система готова к использованию.

3. Животное бритья

1. Выберите место для татуировки лечения. Участок должен быть достаточно прочной, ровной, и мясистый участок кожи, например, в сторону задних ног животного.
2. Anesthetize Balb / C мышей смесью кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг) в зависимости от массы тела животного. Для других животных, относятся к анестезии руководящие принципы вашей организации.
3. Проверьтерефлексы животного, зажимая ее подножия, чтобы подтвердить правильность животных под наркозом.
4. Используйте электрический триммер урезать волосы на задние ноги животного медленно и осторожно. Удалить волосы от запланированного места татуировки и окрестностей.
5. Удалить остаточные короткие волосы одноразовые бритвы безопасности. Будьте осторожны, чтобы не порезать кожу животного. Обратите внимание, что для удаления волос крем может быть использован в качестве альтернативы удаления волос методом, однако мы предпочитаем бритье более депиляции кремом.
6. Удалить беспризорные волосы, вырезанные из кожи с помощью сжатого воздуха при необходимости.

4. Доставка плазмидной ДНК от татуировки

1. Если иммунизация протокол был создан ранее, дозы и объема раствора ДНК, которые должны применяться должны быть рассчитаны соответственно. Мы рекомендуем использовать в качестве небольшого объема, как практическое, чтобы сделать татуировки процесс более управляемым. В этой демонстрации EGFP, мы использовали 7,5 мкл раствора ДНК в конконцентрацией 0,25 мг / мл, которая была нанесена на татуировки площадью около 1 см ^2. Для иммунизации экспериментов, более высокие концентрации пДНК может потребоваться, чтобы вызвать сильную иммунную ^1,2 ответов.
2. Нанесите раствор ДНК с помощью пипетки непосредственно на татуировку сайта. Кроме того, загрузить раствор ДНК в пластиковой рукояткой с помощью пипетки, так что жидкость в подвешенном состоянии между иглой и кончиком пластиковой рукояткой. Смотрите на видео для демонстрации. Мы не наблюдалось заметное различие между двумя методами. Тем не менее, загрузка раствора в пластиковой рукояткой может быть выгодно на вертикальные поверхности кожи, например.
3. Начало колебаний иглы и поместить иглу массив давления света на кожу животного в татуировке сайта. Затем переместите осциллирующей иглу осторожно и медленно в линейном порядке доставить ДНК плазмиды по всей площади татуировки. Поддерживать 90-градусный угол между иглой и кожей, чтобы избежатьрваные раны на коже.
4. Обратите внимание на кожу. Истиранию и воспаление в норме. Если кровотечение происходит, остановить татуировки процесс и уменьшить глубину иглы.
5. Продолжить движение иглы в течение примерно 1 минуты, а затем остановить татуировки процесс.
6. Используйте чистый ватный тампон нанести тонкий слой актуальные обезболивающий на татуировки сайта. Актуальные анальгетики, такие как сульфадиазин серебра крем (крем SSD) или Neosporin мазь может помочь облегчить боль или страдания животных, и поэтому рекомендуется применять их до анестезии прекратит свое действие. Наблюдать за животными на следующий день признаков боли или страдания (изменение походки, бездействия). Повторно обезболивающим кремом, если признаки сохраняются.

5. Подтверждение экспрессии антигена

1. 48 часов после нанесения татуировки лечения (заметим, что различные конструкции пДНК может потребоваться разное время выражение), мышь эвтаназии путем CO ₂ наркоза. Для другихживотных, относятся к эвтаназии руководящие принципы вашей организации.
2. Проанализируйте кожи на татуировке сайте, и закрепить ткань в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение ночи.
3. Промойте ткань с 70% этанола, и передать его в 1X PBS для работы с изображениями.
4. Изучите все ткани с помощью конфокальной микроскопии для проверки сигналов EGFP. Кроме того, ткань кожи может быть встроен в парафин и рассмотрены в разделах под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Выражение EGFP с возбуждением пик при 488 нм и максимумом излучения в 509 нм можно наблюдать в клетках мышиной кожи. От 1,875 мкг дозу ДНК, содержащий около 3 × 10 ¹⁷ копий плазмиды, мы обычно наблюдается 10-20 сигналов EGFP в 1 см ² татуировку области. Это относительно небольшое число трансф?...

Обсуждение

ДНК-вакцинация считается более безопасным, чем традиционные стратегии вакцинации, поскольку она не требует манипуляций, и не подвергайте вакцин, живых или ослабленных возбудителей ^4. Тем не менее, результаты ДНК-вакцинация сильно зависит от маршрута доставки. Кожа богата антиген...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
PCX-EGFP плазмидной ДНК	Clontech
STEALTH Роторная система татуировки	Мира поставки татуировки	STEALTH-L
Татуировка иглы	Мира поставки татуировки	1207RSB
EndoFree плазмиды Kit Maxi	Qiagen	12362
0,22 мкм ПВДФ стерильный фильтр	Millipore	SLGV013SL
электрический триммер волос	Имеющиеся в продаже
одноразовых безопасных бритв	Имеющиеся в продаже
СереброSulfadiazine Cream	Уотсон	NDC 0591-0810-55
Кетамин HCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine стерильный раствор		NADA 139-236