피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

요약

피부 문신은 intradermally 배달 DNA 백신에 대한 강력한하고 안전한 방법입니다. 여기 DNA 플라스미드 인코딩 EGFP는 실험실 쥐의 피부에 문신으로 전달되고 피부 세포에서 EGFP의 표현 그 다음 공 촛점 현미경으로 검사합니다.

초록

핵산 기반의 예방 접종은 성장 관심 주제 immunologically 중요한 항원을 인코딩 특히 플라스미드 DNA (pDNA)입니다. 엔지니어링 pDNA이 백신에 투여 한 후,이 베꼈와 면역 시스템의 반응을 유도 할 수 immunogen 단백질로 번역되어 있습니다. DNA 백신을 제공하는 대부분의 방법은 조사 된 있지만 각 배달 경로는 자신의 장점과 함정이 있습니다. 피부 문신은 안전 비용 효과적인지, 그리고 편리 소설 기법이다. 또한, 바늘 자국으로 구멍은 강력한 도움이되는 역할을 수 있습니다. 여기, 우리가) 플라스미드 DNA 인코딩의 intradermal 배달을 보여 강화 된 녹색 형광 공 촛점 현미경을 사용하여 피부 세포의 EGFP의 효과적인 표현을 확인 문신 장치 및 B)를 사용하여 마우스 모델에서 단백질 (PCX-EGFP).

프로토콜

1. 플라스미드 DNA의 정제

1. DH5α E.coli 관할 세포에 플라스미드 DNA 진핵 세포 인코딩 EGFP (PCX-EGFP)를 변환 할 수 있습니다. 빈 PCX 벡터는 또한 대조군으로 사용하실 수 있습니다.
2. 문화와 수확 DH5α E.coli 세포를하고 Qiagen EndoFree 플라스미드 정화 핸드북에 따라 pDNA를 정화.
3. 필터 pDNA의 0.22 μm PVDF 살균 필터를 통해 솔루션 및 사용하기 전까지 -20 ° C에서 저장합니다.

2. 문신 시스템 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 전원 공급 장치에 핸드 헬드 장치와 제어 페달을 연결합니다.
2. 약 100 Hz에서에 바늘 진동 주파수를 설정합니다. 우리가 (스텔스 로터리 문신 시스템) 선택한 문신 장치, 전원 공급 장치의 다이얼은 4 볼트로 설정해야합니다. 사용자 매뉴얼이나 기타 문신 시스템에 대한 기술 지원을 참조하십시오.
3. 바늘 AR를 검사사용하기 전에 선. 우리는 동물 당 하나의 바늘 어레이를 사용하는 것이 좋습니다. 바늘은 비눗물로 세척하고 autoclaved 후에 재사용 할 수 있습니다.
4. 핸드 헬드 장치에 바늘 어레이를 설치하고 느슨하게 플라스틱 손잡이를 첨부합니다.
5. 위 또는 아래 플라스틱 손잡이를 이동하여 적절한 설정으로 바늘 깊이를 조정합니다. 우리는 우리의 마우스 실험 약 0.5 mm의 바늘 깊이를 사용했습니다.
6. 바늘 깊이가 제대로 설정되어 플라스틱 손잡이를 조여하고, 문신 시스템은 사용할 수 있습니다.

3. 동물 면도

1. 문신 치료 사이트를 선택합니다. 이 사이트는 상대적으로 회사 평면, 그리고 살의 피부의 지역, 예를 들어, 동물의 hindleg의 측면해야합니다.
2. 동물의 체중에 따라 케타민 (90 MG / kg)과 xylazine (5 밀리그램 / kg)의 혼합물 balb / C 마우스를 마취. 다른 동물의 경우 교육 기관의 마취 지침을 참조하십시오.
3. 을 확인동물을 확인하기 위해 발을 곤란하게하여 동물의 반사 신경이 제대로 anesthetized 있습니다.
4. 천천히 그리고 조심스럽게 동물의 hindlegs에서 머리를 잘라하는 전기 트리머를 사용합니다. 계획 문신 사이트와 주변 지역에서 머리를 제거합니다.
5. 일회용 안전 면도기와 잔류 짧은 머리를 제거합니다. 동물의 피부를 잘라하지 않도록주의하십시오. 탈모 용 크림이 다른 헤어 제거 방법으로 사용할 수 있습니다, 그러나, 우리는 탈모 용 크림으로 면도를 선호.
6. 압축 공기 필요한 경우로 피부의 빗나간 컷 머리카락을 제거합니다.

4. 문신의 플라스미드 DNA의 전달

1. 예방 접종 프로토콜은 이전에 설정 한 경우, 복용하고 적용 할 수있는 DNA 솔루션의 볼륨은 그에 따라 계산해야합니다. 우리는 문신 과정을보다 손쉽게 관리 할 수​​ 실제와 같은 작은 볼륨으로 사용하는 것이 좋습니다. 이 EGFP 데모에서, 우리는 사기꾼의 DNA 솔루션의 7.5 μl를 사용약 1cm ^2의 문신 지역에 적용되었습니다 0.25 밀리그램 / ML의 centration. 예방 접종 실험, 높은 pDNA 농도는 강력한 면역 반응의 ^1,2를 유도해야 할 수 있습니다.
2. 문신 사이트에 직접 pipetting하여 DNA 솔루션을 적용합니다. 또는 pipetting하여 플라스틱 그립에 DNA 솔루션을로드하기 때문에 액체는 바늘 및 플라스틱 그립의 끝 사이에 일시 중지됩니다. 데모의 동영상을 참조하십시오. 우리는 두 가지 방법 사이에 눈에 띄는 차이를 관찰 없습니다. 그러나, 플라스틱 그립에 솔루션을로드하는 것은 예를 들어, 수직 피부 표면에 바람직 할 수있다.
3. 바늘 진동을 시작하고 문신 사이트에있는 동물의 피부에 빛을 압력으로 바늘 어레이를 배치합니다. 그런 다음 전체 문신 영역에 플라스미드 DNA를 제공하기 위해 선형 방식으로 부드럽게 천천히 왕복 운동 바늘을 이동합니다. 바늘과 피하기 위해 피부 사이에 90도 각도를 유지피부에 열상.
4. 피부를 관찰. 마모와 염증은 정상입니다. 출혈이 발생하면, 문신 프로세스를 중지하고 바늘 깊이를 줄이십시오.
5. 약 1 분의 바늘 운동을 계속 한 다음 문신 프로세스를 중지합니다.
6. 문신 사이트에 국소 진통제의 얇은 층을 적용하기 위해 깨끗한 면봉을 사용합니다. 이러한 실버 Sulfadiazine 크림 (SSD 크림) 또는 Neosporin 연고와 같은 국소 진통제는 동물의 통증이나 고통을 완화 할 수 있습니다, 따라서 그것은 마취 떨어지기 전에 적용하는 것이 좋습니다. 통증이나 고통 (걸음 걸이, 비활성 변경)의 흔적을 다음 날 동물을 관찰합니다. 신호가 발생하면 진통제 크림을 다시 적용합니다.

5. 항원 표현의 확인

1. 문신 치료 (다른 pDNA 구조가 서로 다른 표현 시간을해야 할 수 있습니다) 후 48 시간이 마우스는 CO ₂ 마취법으로 euthanized 있습니다. 기타의 경우동물, 네 기관의 안락사 지침을 참조하십시오.
2. 문신 사이트에서 피부를 해부, 4 ° C 하룻밤에 4 % paraformaldehyde에 조직을 해결할 수 있습니다.
3. 70 % 에탄올로 조직을 헹구고, 영상에 1X PBS로 전송.
4. EGFP 신호를 확인하기 위해 공 촛점 현미경을 사용하여 전체 조직을 검사합니다. 또는 피부 조직은 파라핀 왁스에 포함하고 형광 현미경 섹션에서 검토 할 수 있습니다.

결과

509 나노 미터에서 488 나노 미터와 방출 피크에서 여기 피크와 EGFP의 표현은 마우스 피부 세포에서 관찰 할 수 있습니다. 약 3 × 포함 DNA의 1.875 μg 선량에서 10 플라스미드 ¹⁷ 사본, 우리는 일반적으로 ² 영역을 문신 1cm에서 10-20 EGFP 신호를 관찰했다. transfected 세포의이 상대적으로 낮은 숫자는 이전 연구 ^(3)의 결과와 일치한다. EGFP 표현 (그림 1) 플라스미드 EGFP가 ...

토론

이 조작을 필요로하거나, 라이브 또는 감소 병원체 ^4로 백신을 제공하지 않는 한 DNA 예방 접종은 기존의 예방 접종 전략보다 더 안전한 것으로 간주됩니다. 그러나, DNA 예방 접종의 결과는 배달 경로에 크게 의존한다. 피부는 Langerhans 세포와 수지상 세포 ^1, 따라서 immunogenicity 및 액세스 ^5,6의 용이성의 측면에서 예방 접종을위한 이상적인 사이트와 항원 제시 세포에 풍부하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
PCX-EGFP 플라스미드 DNA	Clontech
스텔스 로터리 문신 시스템	전세계 문신 공급	은신-L
문신 바늘	전세계 문신 공급	1207RSB
EndoFree 플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12,362
0.22 μm PVDF 무균 필터	Millipore	SLGV013SL
전기 헤어 트리머	상업적으로 이용 가능한
일회용 안전 면도기	상업적으로 이용 가능한
은Sulfadiazine 크림	왓슨	NDC 0591-0810-55
케타민 HCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine 무균 솔루션		나다 139-236