تطبيق أدوية المحلية لدراسة وظيفة مستقبلات أستيل النيكوتينيك في شرائح مخ الفأر

Summary

في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة مفيدة لدراسة يجند القناة الايونية بوابات وظيفة الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح معزولة تماما. هذا الأسلوب ينطوي على استخدام المخدرات micropipette مليئة للاستخدام الموضعي من الأدوية إلى الخلايا العصبية باستخدام معيار تقنيات سجلت المشبك التصحيح.

Abstract

تعاطي التبغ يؤدي إلى مشاكل صحية عديدة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب وانتفاخ الرئة، والسكتة الدماغية. الإدمان على تدخين السجائر هو اضطراب السائد العصبية والنفسية التي تنبع من الإجراءات الفيزيائية الحيوية والخلوية من النيكوتين على مستقبلات النيكوتين أستيل (nAChRs) في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. فهم أنواع فرعية مختلفة nAChR التي توجد في مناطق الدماغ ذات الصلة لإدمان النيكوتين هو أولوية رئيسية.

التجارب التي تستخدم تقنيات الكهربية مثل المشبك التصحيح خلية كاملة أو ثنائية القطب التسجيلات المشبك الجهد مفيدة لتوصيف الدوائية للnAChRs المصالح. يتم عزل الخلايا جسديا nAChRs التعبير عن مثل الثدييات خلايا البويضات أو زراعة الأنسجة القيطم المورق، وبالتالي فهي تدرس بسهولة باستخدام أدوات علم الأدوية الحديثة. وقد أحرز تقدم كبير باستخدام هذه التقنيات، وخاصة عندما كان معروفا بالفعل لمستقبلات الهدفوقد تحقق بسهولة الثانية خارج الرحم التعبير. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، فمن الضروري دراسة nAChRs في بيئتها الأصلية: في الخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح تحصد تماما من الفئران المختبرية أو الفئران. على سبيل المثال، الفئران معربا عن "الحساسية" مفارز nAChR مثل الفئران L9'A α4 ¹ و الفئران α6 L9'S ^2، تسمح لتحديد لا لبس فيها من الخلايا العصبية على أساس التعبير الوظيفية من حدة فرعية nAChR محددة. على الرغم من القيام به بشكل روتيني خلية كاملة التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ من قبل شرائح الكهربية المهرة، فإنه يمثل تحديا لتطبيق محليا المخدرات مثل النيكوتين أستيل أو إلى داخل الخلية سجلت شريحة الدماغ. التخفيف من المخدرات إلى superfusate (تطبيق حمام) لا يمكن عكسها بسرعة، ولا U-أنبوب نظم تتكيف بسهولة للعمل مع شرائح الدماغ.

في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لتطبيق بسرعة nAChR-تفعيل المخدرات إلى الخلايا العصبية المسجلة في م الكبار[أوس] شرائح الدماغ. يتم إجراء القياسية خلية كاملة من الخلايا العصبية في التسجيلات شرائح، وناور لmicropipette الثانية المملوءة دواء من الاهتمام إلى موقف بالقرب من الخلية المسجلة. حقنة من الهواء المضغوط أو النيتروجين خامل في ماصة المخدرات مليئة يسبب كمية صغيرة من المخدرات حل يمكن إخراجه من ماصة على الخلية المسجلة. باستخدام هذا الأسلوب، nAChR بوساطة تيارات قادرة على أن تحل بدقة ميلي ثانية واحدة. يمكنك بسهولة تطبيق مرات المخدرات أن تختلف، ويمكن سحب ماصة المخدرات مليئة واستبدالها ماصة جديدة، والسماح لأن يتم إنشاء منحنيات التركيز والاستجابة لالخلايا العصبية واحدة. على الرغم من وصفها في سياق بيولوجيا الأعصاب nAChR، ينبغي أن تكون مفيدة هذه التقنية لدراسة أنواع عديدة من القنوات الأيونية يجند بوابات أو المستقبلات في الخلايا العصبية من الدماغ شرائح.

Protocol

1. إعداد حلول لإعداد شريحة الدماغ والكهربية

1. وقد وصفت سابقا الحلول لإعداد شرائح الدماغ ^{3 و 4.} إعداد N-D-glucamine الميثيل (NMDG) على أساس القطع والانتعاش الحل للتكوين التالية (مم): 93 ن ميثيل D-glucamine، 2.5 بوكل، 1.2 ناه ₂ PO _{4 و} 30 NaHCO _{3 و} 20 HEPES، 25 الجلوكوز، 5 أسكوربات ⁺ نا (2)، ثيوريا، 3 البيروفات ⁺ نا، 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O، 0.5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع NMDG. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك N 10.
   1. حل MgSO ₄ • 7H ₂ O وCaCl ₂ • 2H ₂ O في الماء لجعل ميليبور 2 حلول الأسهم M لكل منها.
   2. تزن من المكونات الأخرى حسب الترتيب المسرود وإضافة إلى تعبئة القارورة الحجمية جزئيا مع الماء مع التحريك ميليبور حل. مرة واحدة يتم إضافة كل شيء، وملءالحجمي قارورة مع الماء ميليبور.
   3. قياس درجة الحموضة وحمض الهيدروكلوريك مع ضبط N 10.
   4. قياس وضبط الأسمولية مع NMDG إذا لزم الأمر.
2. إعداد عقد HEPES السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) من التشكيل التالي (مم): 92 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1.2 ناه ₂ PO _{4 و} 30 NaHCO _{3 و} 20 HEPES، 25 الجلوكوز، 5 أسكوربات ⁺ نا (2)، ثيوريا، 3 نا ⁺ البيروفات، 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O، 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع السكروز. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو N 1.
   1. تزن من المكونات في الترتيب المسرود وإضافة إلى تعبئة القارورة الحجمية جزئيا مع الماء مع التحريك ميليبور حل. مرة واحدة يتم إضافة كل شيء، وملء القارورة الحجمية بالماء ميليبور.
   2. قياس درجة الحموضة وضبط مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك إذا لزم الأمر.
   3. قياس وضبط الأسمولية مع السكروز إذا لزم الأمر.
3. إعداد معيار حل ACSF من تسجيل على التشكيل التالي (مم): 124 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 1.2 ناه O. ₂ PO _{4 و} 24 NaHCO _3، 12،5 الجلوكوز، 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O، 2 CaCl ₂ • 2H ₂ التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع السكروز. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو N 1.

2. إعداد شرائح الدماغ الحادة

1. تتم الدماغ قطع شريحة والانتعاش كما هو موضح سابقا ^{3 و 4.} أطباق الكريستال فقاعة مليئة 2 NMDG الانتعاش الحل مع الأكسجين 95٪ / 5٪ CO غاز ₂ (كربوجين)، طبق واحد على الجليد، والآخر في 33 ° C.
2. طبق فقاعة الكريستال احدة مليئة HEPES عقد ACSF مع كربوجين في درجة حرارة الغرفة.
3. تخدير الماوس الكبار (تتراوح أعمارهم بين 2 إلى 12 شهرا) مع نا ⁺ بنتوباربيتال (200 ملغ / كغ، والملكية الفكرية). المضي قدما في الإجراء عند الحيوان لا يوجد لديه استجابة لقرصة أخمص قدميه.
4. إذا لزم الأمر، وقطع الذيل لعينة الأنسجة genotyp في وقت لاحقجي للحيوان.
5. فتح تجويف الصدر، تعرض القلب، والشريان الأورطي النازل المشبك. ممزق الأذين الأيمن.
6. يروي Transcardially الحيوانية مع مل 5-10 من 0-4 ° حل NMDG لاسترداد C.
7. قطع رأس الحيوان، وإزالة الدماغ ووضعه في 4 ° حل NMDG لاسترداد C لمدة 1 دقيقة.
8. على صفيحة معدنية الجليد المبردة، وتقليم الدماغ في الاتجاه المطلوب (الاكليلية، مجاور للسهمي، أفقي، وما إلى ذلك) لتشمل مجال الاهتمام.
9. يضعوا كتلة الدماغ مع superglue إلى السطح مرحلة تقطيع اللحم الجاف لتهتز (DSK الصفر 1؛ Dosaka)، يغرق كتلة الدماغ في 4 ° C NMDG لاسترداد الحل، والحل فقاعة مستمر مع كربوجين.
10. قطع شرائح من منطقة الدماغ من الفائدة. سمك شريحة هو 200-400 ميكرون، اعتمادا على المنطقة الدماغ المحددة التي تهم، العمر الحيوان، والتجربة التي يتعين القيام بها.
11. مباشرة بعد القطع، احتضان شرائح المطلوب في carbogenated، 33 ° C NMDG لاسترداد solutiعلى لبالضبط 12 دقيقة، ثم نقل إلى carbogenated، HEPES عقد درجة حرارة الغرفة حل لفترة أولية مدتها 60 دقيقة. بعد هذا حضانة 60 دقيقة، يمكن استخدام شرائح للتسجيل. يتم الاحتفاظ شرائح HEPES في حل عقد على مدار اليوم حتى يتم استخدامها للتسجيل.

3. تسجيل التصحيح المشبك من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح

1. سحب micropipette التصحيح القياسية مع مجتذب المشتعلة براون للبرمجة (سوتر P-97 أو الرأسي مجتذب ما يعادلها). ماصات التي هي الأمثل لتشكيل ختم جيجا أوم المقاومة وعادة ما يكون من 4-6 MΩ
2. نقل شريحة واحدة إلى غرفة التسجيل (RC-27L، آلات وارنر) على مسرح المجهر تستقيم (نيكون FN-1). superfuse باستمرار (1،5 حتي 2،0 مل / دقيقة) مع شريحة carbogenated، ACSF القياسية تسجيل والحفاظ على تسخين 32 ° C. وبدلا من ذلك، يمكن الحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة.
3. تحديد موقع ومركز منطقة الدماغ ذات الاهتمام الخاصهدف الهواء 10X (نيكون خطة فلور 10X؛ NA 0.3؛ WD: 16 مم).
4. اتهم متصلة المقابل تدخل IR-الفرق (DIC) البصريات وعالية السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء جهاز يقترن تصور الخلايا العصبية الفردية باستخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة 40X الغمر بالماء (IR) الهدف (3.5 ملم نيكون APO 40XW؛:؛ NA WD 0.80) (CCD) كاميرا فيديو (C-7500 هاماماتسو). تحت IR-DIC المراقبة، والخلايا العصبية السليمة يحمل على نحو سلس، غشاء البلازما رمادي فاتح.
5. ملء micropipette مع حل التسجيل داخل الخلايا مناسب. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ونحن نستخدم الحل التالي (مم): 135 غلوكونات البوتاسيوم، 5 EGTA، 0.5 CaCl _{2، 2} MgCl _{2 و} 10 HEPES، 2 ملغ-ATP، و 0.1 GTP (درجة الحموضة تعديلها إلى 7.25 مع قاعدة تريس، الأسمولية تعديل إلى 290 الميلي أسمول مع السكروز). إنشاء تسجيل خلية كاملة من الخلايا العصبية تصور.

4. تطبيق أدوية المحلية إلى الخلايا العصبية في شرائح

1. سحب المشبك التصحيح القياسية micropipette كما هو موضح أعلاه. باستخداممجتذب ماصة مثل سوتر P-97 التي ينتج اثنين متطابقة "الشقيقة" نصائح من نفس قطعة من الزجاج هو مفيد عندما المخدرات حلول متعددة لاستخدامها في الخلية نفسها. تلميح الأحجام التي من شأنها أن يكون لها مقاومة ~ 5 MΩ إذا أنها كانت تملأ الحل داخل الخلايا المذكورة أعلاه هي الأمثل.
2. الردم وmicropipette بمحلول مكون من المخدرات مخففة في carbogenated، ACSF تسجيل القياسية. ويشير الطرف الأسفل، ونفض الغبار micropipette المخدرات مملوءة لإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس في العمود من الحل.
3. تحميل micropipette المخدرات مليئة في حامل ماصة متصلة مع أنابيب الضغط لنظام طرد مناسبة، مثل III Picospritzer (عام شركة صمام). يجب أن يتم تنظيمها حامل ماصة في الصعود إلى مياداة مجهرية لهذا القرار نفس المتلاعبين تستخدم عادة لتسجيل المشبك التصحيح (على سبيل المثال، سوتر MP-285). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تتلاعب تسمح للحركة داخل وخارج قطر للشريحة. رجلإخراج ually الضغط 3 إلى 4 مرات في micropipette من أجل بناء الضغوط الكافية وراء عمود من السوائل.
4. باستخدام عناصر التحكم مياداة مجهرية، وانخفاض ماصة المخدرات في حين تصور شريحة غيض تحت IR-DIC البصريات. من الناحية المثالية، ينبغي للمرء تحديد البصر ومركز الخلايا العصبيه التي سيتم تسجيلها من، تليها المواقع من المخدرات بالقرب من ماصة الخلية قبل تخفيض micropipette تسجيل في شريحة. يمكن تحديد المواقع ماصة المخدرات تسبب حركة الأنسجة في محيط الخلية مسجل يمكن ان تعطل تسجيل إذا تم نقل ماصة المخدرات في موقف بعد إنشاء ختم gigaohm.
5. باستخدام الفيديو IR، ضع micropipette المخدرات على السطح العلوي للشريحة الأنسجة. تنفيذ واحدة طرد الضغط ورصد 1) على مقربة من الحافة لحركة الحطام المتصلة طرد، و 2) الطرف micropipette عن أي دلائل أن انسداد تلميح أو مسدودة. إذا تم حظر غيض / انسداد، التراجع عن pipettه واستبدالها بأخرى جديدة.
6. الاقتراب من الخلية مسجل قطريا من الجزء العلوي من شريحة بحيث عندما تكون في موقف نهائي، غيض من ماصة المخدرات مملوءة هو 1) في الطائرة التنسيق نفسه (أو أقل قليلا) كما سجلت الخلية وغيض من القطب تسجيل ، و 2) 10 حتي 40 ميكرون من الخلية المسجلة. إذا غيض ماصة المخدرات مملوءة هو أعلى الخلية المسجلة، يمكن لقوة الضغط من طرد تعطيل ختم gigaohm.
7. تسجيل الاستجابة المطلوبة الخلوية في حين عقد الخلية في وضع المشبك الجهد أو التيار وضع المشبك. نسجل بشكل روتيني أستيل و / أو النيكوتين أثار التيارات الخلوية أثناء الضغط الخلايا العصبية في وضع المشبك الجهد. على الرغم من أن يمكن أن تسبب طرد ضغط يدويا عند استخدام III Picospritzer، من أجل البحث استنساخه فإنه من المستحسن لتشغيل طرد الضغط باستخدام نظام الحصول على (أكسون Digidata 1440 وpClamp 10.3) مع نبض TTL الرقمية.

5. السيطرةوMicropipette المخدرات مليئة مترجم كهرضغطية

1. إذا كان ذلك ممكنا، تحميل حامل ماصة المخدرات مملوءة لمترجم واحد البعد كهرضغطية (مثل Piezojena PA-100 أو بيرلي PZM-150) التي هي قادرة على قبول المدخلات الجهد التناظرية (مرة أخرى، من نظام الحصول على)، والذي هو ثم شنت على لمياداة مجهرية عالية الدقة (سوتر MP-285). A مترجم كهرضغطية مفيد لأنه يمكن لحركة ماصة المخدرات مملوءة داخل وخارج الشريحة، بما في ذلك توقيت وسرعة الدخول / الخروج، وتسيطر بسهولة أكبر مستنسخة من التجربة في تجربة. عند دراسة nAChRs، وآثار مزيل للتحسس من تسرب النيكوتين من المخدرات ماصة مملوءة، إذا ما وقعت أي وقت مضى، إلى أدنى حد ممكن عند نقل فقط ماصة بالقرب من الخلية مع مترجمة كهرضغطية لحظة طرد الضغط.
2. باستخدام الجهد يدويا التي تسيطر عليها مكبر للصوت على السيطرة على الجهد كهرضغطية، اطلب الجهدإلى قيمته القصوى.
3. باستخدام مياداة مجهرية، ضع ماصة المخدرات مليئة في شريحة حيث سيتم إخراج ماصة محتوياته على الخلية المسجل، وسحب ماصة عن طريق تخفيض الجهد يدويا إلى الصفر على مكبر للصوت الجهد السيطرة كهرضغطية.
4. باستخدام إشارة خرج التناظرية من تسجيل نظام حيازة، نقل المخدرات ماصة مملوءة إلى شريحة على مدى فترة من 250 ميللي ثانية ابتداء 300 ميللي ثانية قبل ضغط طرد TTL نبض يحدث. سحب ماصة على مدى فترة من 250 ميللي ثانية، ابتداء 50 ميللي ثانية بعد انتهاء نبض TTL.

النتائج

في تجاربنا، ونحن بشكل روتيني من تسجيل الدوبامين (DA) الخلايا العصبية المنتجة للفي المنطقة الجوفية السقيفية (VTA) والمادة السوداء الجزء المكتنزة (SNC). في الجهد المشبك واسطة، وتطبيق ضغط أستيل النيكوتين أو لهذه الخلايا يؤدي عادة في السريع، الموجبة الحالية التي تصل إلى ذروت...

Discussion

الأسلوب الواردة في هذه الوثيقة على نطاق واسع هو مفيد لدراسة يجند القناة الايونية بوابات ظيفة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. ومع ذلك، هناك عدد من العوامل التي من شأنها أن تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية واستنساخ البيانات التجريبية التي تنتج عن استخدام هذه الطريقة. عل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-ميثيل D-glucamine	سيجما	M2004
بوكل	سيجما	P3911
ناه 2 PO 4	سيجما	S9638
NaHCO 3	سيجما	S6014
HEPES	سيجما	H3375
الجلوكوز	سيجما	G5767
نا + أسكوربات	سيجما	A4034
ثيوريا	سيجما	T8656
نا + البيروفات	سيجما	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	سيجما	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	سيجما	223506
كلوريد الصوديوم	سيجما	S9625
نا +	نوادي المضاربة والإستثمار الصيدلة	76351315
غلوكونات البوتاسيوم	سيجما	G4500
EGTA	سيجما	E3889
المغنيسيوم-ATP	سيجما	A9187
GTP	سيجما	G8877
DSK-ZERO 1 بالاهتزاز تقطيع اللحم	تيد بيلا، شركة
P-97 المشتعلة / براون micropipette مجتذب	سوتر
غرفة RC-27 تسجيل	وارنر
سخان TC-344B الإرواء تحكم	وارنر	640101
SH-27B الحل سخان	وارنر	640102
نيكون FN-1	نيكون
فيديو CCD C-7500 كاميرا	هاماماتسو
Picospritzer III	عام شركة صمام
MP-285 مياداة مجهرية	سوتر
PA-100 مترجم كهرضغطية	piezosystem جينا، وشركة
12V40 بيزو مكبر للصوت	piezosystem جينا، وشركة
Axopatch 200B	الجزيئي الأجهزة كورب
Digidata 1440A	الجزيئي الأجهزة كورب