Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Zusammenfassung

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Zusammenfassung

Tabakkonsum führt zu zahlreichen gesundheitlichen Problemen wie Krebs, Herzkrankheiten, Emphysem und Schlaganfall. Sucht nach Zigarettenrauchen ist eine weit verbreitete neuropsychiatrische Erkrankung, die von den biophysikalischen und zellulären Wirkungen von Nikotin auf Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) im gesamten zentralen Nervensystem beruht. Das Verständnis der verschiedenen nAChR Subtypen, in Hirnregionen, die für Nikotinsucht existiert ist eine wichtige Priorität.

Experimente, die Elektrophysiologie Techniken wie whole-cell Patch-Clamp-oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, sind für die pharmakologische Charakterisierung von nAChRs von Interesse nützlich. Exprimieren nAChRs, wie Säuger Gewebekulturzellen oder Xenopus laevis Oozyten sind galvanisch getrennt und können daher leicht studiert mit den Mitteln der modernen Pharmakologie. Große Fortschritte wurden gemacht mit diesen Techniken, insbesondere wenn die Target-Rezeptor bereits bekannt wurdend ektopische Expression wurde problemlos erreicht. Oft ist es jedoch notwendig, um nAChRs in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren: in Neuronen innerhalb Hirnschnitten akut vom Labor Mäusen oder Ratten geerntet. Beispielsweise exprimieren mice "hypersensitiven" nAChR-Untereinheiten wie α4 L9'A Mäusen ¹ und α6 L9'S Mäusen ^2, zur eindeutigen Identifizierung der Neuronen auf ihre funktionelle Expression eines spezifischen nAChR-Untereinheit basierend ermöglichen. Obwohl whole-cell Patch Clamp Messungen von Neuronen in Hirnschnitten wird routinemäßig durch den Fachmann Elektrophysiologen getan, ist es eine Herausforderung vor Ort gelten Drogen wie Acetylcholin oder Nikotin auf die aufgezeichneten Zelle innerhalb eines Hirnschnitt. Verdünnung der Wirkstoffe in die Superfusat (Badapplikation) nicht schnell reversible und U-Rohr-Systeme sind nicht leicht angepasst, um mit Hirnschnitten arbeiten.

In diesem Papier beschreiben wir ein Verfahren zur schnellen Anwendung nAChR-aktivierende Medikamente Neuronen im erwachsenen m erfasstOuse Hirnschnitten. Standard Ganzzellableitungen aus Neuronen in Scheiben hergestellt, und ein zweites Mikropipette mit einem Medikament gefüllt ist von Interesse in Position in der Nähe der Zelle aufgenommen manövriert. Eine Injektion von Druckluft oder inerten Stickstoff in das Medikament gefüllten Pipette entsteht eine kleine Menge an Arzneimittel Lösung aus der Pipette auf die aufgezeichnete Zelle ausgestoßen werden. Mit dieser Methode sind nAChR-vermittelten Ströme können mit Millisekunden-Genauigkeit gelöst werden. Medikamentenapplikation mal leicht variiert werden, und das Arzneimittel gefüllten Pipette kann zurückgezogenen und mit einer neuen Pipette ersetzt werden, so dass für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für ein einziges Neuron geschaffen werden. Obwohl im Rahmen der nAChR Neurobiologie beschrieben wurde, sollte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung vieler Arten von Liganden-gesteuerte Ionenkanäle oder Rezeptoren im Gehirn Neuronen von Scheiben.

Protokoll

Ein. Herstellung von Lösungen für Brain Scheibe Vorbereitung und Elektrophysiologie

1. Lösungen für die Herstellung von Hirnschnitten wurden bisher ^{3, 4} beschrieben. Planen N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-basierten Schneiden und Recovery-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): 93 N-Methyl-D-Glucamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na ⁺ Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na ⁺ Pyruvat, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit NMDG. PH-Wert auf 7,3-7,4 mit 10 N HCl.
   1. Lösen MgSO ₄ • 7H ₂ O und CaCl ₂ • 2H ₂ O in Millipore Wasser zu 2 M Stammlösungen von jedem machen.
   2. Abzuwiegen anderen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllenMesskolben mit Millipore-Wasser.
   3. Messen Sie den pH-Wert und die Einstellung mit 10 N HCl.
   4. Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie mit NMDG wenn nötig.
2. Planen HEPES Halten künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) der folgenden Zusammensetzung (in mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na ⁺ Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na ⁺ Pyruvat, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH.
   1. Abzuwiegen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllen Messkolben mit Millipore-Wasser.
   2. Messung des pH-Wertes und Einstellen mit NaOH oder HCl, wenn nötig.
   3. Messen Sie die Osmolarität und stellen mit Saccharose, wenn nötig.
3. Standardlösungen aCSF Aufzeichnungs-Lösung folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, 12,5 Glucose, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH.

2. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten

1. Gehirnscheibe Schneiden und Wiederherstellung erfolgen wie zuvor ^{3, 4} beschrieben. Bubble zwei Kristall Gerichte mit NMDG Recovery-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO _2-Gas (Carbogen), eine Schüssel auf dem Eis, die andere bei 33 ° C gefüllt
2. Blase ein Kristall Schale mit HEPES Halten aCSF mit Carbogen bei Raumtemperatur gefüllt.
3. Anesthetize erwachsenen Maus (im Alter von 2 bis 12 Monaten) mit Na ⁺ Pentobarbital (200 mg / kg, ip). Fahren Sie mit dem Vorgang, wenn das Tier hat keine Antwort auf eine toe-Prise.
4. Falls erforderlich, einen Schwanz Gewebeprobe für eine spätere GenotypIng. des Tieres.
5. Öffnen Sie die Brusthöhle, Setzen Sie das Herz, und klemmen Sie die absteigende Aorta. Aufschlitzen den rechten Vorhof.
6. Transkardial perfundieren Tier mit 5-10 ml 0-4 ° C NMDG-Recovery-Lösung.
7. Enthaupten Tier, entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung für 1 min.
8. Auf einer eisgekühlten Metallplatte, schneiden das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, horizontal, etc.), um den Bereich in der Nähe sind.
9. Bringen Sie das Gehirn Block mit Sekundenkleber auf die trockene Bühne Oberfläche eines vibrierenden Allesschneider (DSK-Zero 1; Dosaka), tauchen das Gehirn Block in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung, und kontinuierlich bubble die Lösung mit Carbogen.
10. Angeschnitten des Gehirns Bereich von Interesse. Scheibendicke beträgt 200-400 um, abhängig von der spezifischen Gehirn interessierenden Bereich, tierische Alter und Experiment durchzuführen.
11. Unmittelbar nach dem Schneiden carbogenated inkubieren gewünschten Scheiben, 33 ° C NMDG-Recovery-Löauf genau 12 min, dann carbogenated, Raumtemperatur HEPES hält Lösung für einen anfänglichen Zeitraum von 60 min zu übertragen. Nach dieser 60 min Inkubation kann Scheiben für Aufnahmen verwendet werden. Scheiben werden in HEPES halten Lösung den ganzen Tag, bis sie für die Aufnahme verwendet werden beibehalten.

3. Patch Clamp Aufnahme von Neuronen im Gehirn Slices

1. Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einer programmierbaren Flaming-Brown Puller (Sutter P-97 oder gleichwertig vertikale puller). Pipetten, die optimal für Giga-Ohm Dichtung Formation sind typischerweise einen Widerstand von 4-6 MOhm
2. Übertragen einer Scheibe zur Aufnahme Kammer (RC-27L; Warner Instruments) auf der Stufe eines aufrechten Mikroskop (Nikon FN-1). Kontinuierlich superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) die Scheibe mit carbogenated, Standard-Aufnahme aCSF erhitzt und bei 32 ° C gehalten Alternativ kann Scheiben bei Raumtemperatur gehalten werden.
3. Suchen und in der Mitte des Gehirns Bereich von Interesse mita 10X Luftobjektiv (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
4. Visualisieren einzelnen Neuronen mit einem 40X Nah-Infrarot-(IR-) Wasser Immersionsobjektiv (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) mit IR-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik und einem High-Speed-nahen Infrarot charged coupled device (CCD) Videokamera (Hamamatsu C-7500). Unter IR-DIC Beobachtung, weisen gesunde Neuronen eine glatte, hellgraue Plasmamembran.
5. Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten intrazellulären Recording-Lösung. Für die meisten Anwendungen, verwenden wir die folgende Lösung (in mM): 135 Kaliumgluconat, 5 EGTA, 0,5 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP und 0,1 (pH-Wert auf 7,25 mit Tris-Base, Osmolarität eingestellt eingestellt auf 290 mOsm mit Saccharose). Stellen Sie eine whole-cell-Aufnahme von einer visualisierten Neurons.

4. Lokale Anwendung von Medikamenten zu Neuronen in Scheiben

1. Ziehen Sie ein Standard-Patch-Clamp-Mikropipette wie oben beschrieben. Miteine Pipette Abziehvorrichtung wie eine Sutter P-97, die zwei identische "Schwester" Spitzen aus dem gleichen Stück Glas produziert, ist von Vorteil, wenn multiple drug Lösungen auf derselben Zelle verwendet werden sollen. Tip Größen, die einen Widerstand von ~ 5 MW haben würden, wenn sie mit der intrazellulären oben beschriebenen Lösung gefüllt wurden, sind optimal.
2. Hinterfüllung die Mikropipette mit einer Lösung des Wirkstoffs in carbogenated, Standard-Aufzeichnungs aCSF verdünnt. Richten Sie die Spitze nach unten, und Flick die Droge gefüllte Mikropipette, um Luftblasen in der Spalte der Lösung aufgefangen entfernen.
3. Montieren das Medikament gefüllte Mikropipette in einem Pipettenhalter mit Schlauch an einem geeigneten Druck Lastausstoßsystem wie eine Picospritzer III (General Valve Co.) verbunden ist. Der Pipettenhalter sollte auf einem Mikromanipulator mit der gleichen Auflösung montiert werden als Manipulatoren allgemein für Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet (z. B. Sutter MP-285). Außerdem sollte der Manipulator für diagonale Bewegungen in und aus der Scheibe zu ermöglichen. Mannmanuell auswerfen Druck 3 bis 4 Mal in die Mikropipette, um den Aufbau ausreichender Druck hinter der Säule der Flüssigkeit.
4. Mit den Mikromanipulator Kontrollen senken das Medikament Pipette in der Scheibe, während die Visualisierung der Spitze unter IR-DIC-Optik. Idealerweise sollte ein visuell zu identifizieren und in der Mitte ein Neuron aus aufgezeichnet werden, durch Positionieren des Medikaments Pipette nahe der Zelle vor dem Absenken des Aufzeichnungs Mikropipette in die Scheibe folgt. Positionieren der Pipette kann Medikaments Bewegung von Gewebe in der Nähe der Zelle, die die aufgezeichneten Aufzeichnungs stören könnte, wenn das Medikament Pipette in die Position nach Festlegung eines Gigaohm Dichtung bewegt verursachen.
5. Verwendung von IR-Video, das Medikament zu positionieren Mikropipette an der oberen Fläche des Gewebeschnitts. Ausführen ein Druck Ausstoßen und Monitor 1) der Umgebung der Spitze für eine Bewegung von Trümmern im Zusammenhang mit dem Ausstoßen, und 2) die Mikropipettenspitze auf Anzeichen, daß die Spitze verstopft oder blockiert. Wenn die Spitze blockiert / verstopft, zurückziehen pipette und ersetzen sie durch eine neue.
6. Nähern das aufgezeichnete Zelle diagonal von oben der Scheibe derart, dass, wenn in der Endposition ist die Spitze des Medikaments gefüllten Pipette 1) in derselben Fokalebene (oder leicht darunter) als aufgezeichnete Zelle und der Spitze der Aufzeichnungselektrode und 2) 10 bis 40 um aus dem aufgenommenen Zelle. Wenn das Medikament gefüllte Pipettenspitze ist oberhalb des aufgezeichneten Zelle könnte die Kraft von dem Druck Ausstoßen stören die Gigaohm Dichtung.
7. Notieren Sie die gewünschte zelluläre Reaktion, während die Zelle in Voltage-Clamp-Modus oder Stromzange Modus. Wir routinemäßig aufzeichnen Acetylcholin und / oder Nikotin-induzierte zelluläre Ströme, während Neuronen im Voltage-Clamp-Modus. Obwohl Druck Ausstoßen manuell ausgelöst werden kann, wenn unter Verwendung eines Picospritzer III, für mehr reproduzierbare Ergebnisse empfiehlt es sich, den Druck über das Ausstoßen Erfassungssystem (Axon Digidata 1440 und pClamp 10.3) mit einem digitalen TTL-Impuls auszulösen.

5. RegelungDie Drug-gefüllte Mikropipette mit einem piezoelektrischen Übersetzer

1. Wenn möglich, den Wirkstoff gefüllten Pipettenhalter um ein eindimensionales piezoelektrischen Übersetzer (zB Piezojena PA-100 oder Burleigh PZM-150), die in der Lage zur Annahme eines analogen Spannungseingang (wiederum aus der Übernahme-System), welches dann ist befestigt auf der hochpräzisen Mikromanipulator (Sutter MP-285). Piezoelektrischer Übersetzer ist nützlich, da die Bewegung des Medikaments gefüllten Pipette in die und aus der Scheibe, einschließlich des Zeitpunkts und der Geschwindigkeit der Eingangs / Ausgangs, leichter beherrscht werden kann, und wiedergegeben von Experiment zu Experiment. Bei der Untersuchung von nAChR, die desensibilisierende Wirkung von Nikotin Leckage aus dem Arzneimittel gefüllten Pipette, sollten sie je vorkommen, werden minimiert, wenn die Pipette wird nur in der Nähe der Zelle mit einem piezoelektrischen Übersetzer verschoben auf den Augenblick der Druck Ausstoßen.
2. Mit dem manuell gesteuerten Potentiometer auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker, wählen Sie die Spannungum ihren maximalen Wert.
3. Mit dem Mikromanipulator, Position der Droge gefüllte Pipette in der Scheibe, wo die Pipette seinen Inhalt auf die aufgezeichneten Zelle wird ausgeworfen, und Einfahren der Pipette durch manuelle Reduzierung der Spannung auf Null auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker.
4. Verwendung eines analogen Ausgangssignals von dem Aufzeichnungs-Erfassungssystem, bewegen das Medikament gefüllten Pipette in das Segment über einen Zeitraum von 250 msec beginnend 300 msec bevor der Druck Ausstoßen TTL-Impuls auftritt. Einfahren der Pipette über einen Zeitraum von 250 msec, 50 msec beginnend nach der TTL-Impuls endet.

Ergebnisse

In unseren Experimenten haben wir routinemäßig von Dopamin (DA)-produzierenden Neuronen des ventralen Tegmentum (VTA) und der Substantia nigra pars compacta (SNC) aufzuzeichnen. Im Spannungs-Clamp-Modus wird Druckbeaufschlagung von Acetylcholin oder Nikotin an diese Zellen typischerweise in einer schnellen, einwärts Kationenstrom die Spitze erreicht innerhalb von 100 bis 200 ms (Fig. 1A-B) führen. Abklingen des Stroms wird weitgehend durch die Diffusion des Arzneimittels aus dem Wirkort diktiert, un...

Diskussion

Das Verfahren in diesem Papier ist weitgehend nützlich für die Untersuchung Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Hirnschnitt Vorbereitungen. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflussen die Qualität und Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten, die sich aus der Verwendung dieser Methode. Beispielsweise sind hervorgerufene Ströme sehr empfindlich auf den Durchmesser der Spitze des Arzneimittels gefüllten Pipette. Kleine Tipps werden Schwierigkeiten mit Ausstoßen der Arzneimittellösung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Methyl-D-glucamin	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G5767
Na + Ascorbat	Sigma	A4034
Thioharnstoff	Sigma	T8656
Na + Pyruvat	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Kaliumgluconat	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 Vibrations-Allesschneider	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung	Sutter
RC-27 Recording Kammer	Warner
TC-344B Perfusion Heizungsregler	Warner	640101
SH-27B Lösung Heizer	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD Video Kamera	Hamamatsu
Picospritzer III	General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator	Sutter
PA-100 Piezo-Übersetzer	Piezosystem jena, Inc.
12V40 Piezoverstärker	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp