マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

要約

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。

要約

タバコの使用は、がん、心臓病、肺気腫、脳卒中を含む多数の健康上の問題につながる。喫煙への依存症は、中枢神経系全体のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）ニコチンの生物物理学的および細胞作用に由来する流行精神神経疾患である。ニコチン中毒に関連する脳領域に存在するさまざまなnAChRをサブタイプを理解することは、主要な優先事項です。

このような全細胞パッチクランプまたは二電極電圧クランプ記録として電気生理学的手法を採用した実験では、目的のnAChRsの薬理学的特性評価のために有用である。このような哺乳動物組織培養細胞やアフリカツメガエル卵母としてnAChRsを発現する細胞は、物理的に分離されているので、簡単に現代の薬理学のツールを用いて研究されている。標的受容体が既に知られていた場合は特に多くの進歩は、これらの技術を用いて製造されていますND異所性発現は容易に達成された。急性実験用マウスまたはラットから採取した脳スライス内のニューロンに：多くの場合、しかし、それは彼らのネイティブ環境でnAChRsを検討する必要がある。例えば、α4L9'Aマウス¹およびα6L9のMICE ²として"過敏" nAChRをサブユニットを発現するマウスは、特定のnAChRをサブユニットのそれぞれの機能発現に基づいて神経細胞の明確な識別を可能にします。脳スライスのニューロンからホールセルパッチクランプ記録を日常的に熟練した電気生理学者によって行われていますが、局所的に、アセチルコリンや脳スライス内に​​記録された細胞にニコチンなどの薬物を適用するために挑戦している。 superfusateに薬の希釈（浴アプリケーション）は、急速に可逆的ではなく、U字管のシステムを容易に脳スライスで動作するように適合されていない。

本稿では、急速に大人メートルで記録ニューロンにnAChRを活性化薬を適用するための方法を説明します脳スライスをウーズ。標準細胞全体の録音は、スライスのニューロンから作られており、興味のある薬剤を充填した第二マイクロピペットは記録セルに近い位置に操縦される。薬剤を充填したピペットに加圧された空気または不活性窒素の注入は、記録されたセル上にピペットから吐出される薬液の少量を引き起こす。この方法を使用して、nAChRを媒介電流は、ミリ秒の精度で解決することができるようになりました。医薬品申請時間は簡単に変えることができ、薬剤を充填したピペットは、単一ニューロンのために作成される濃度応答曲線を可能にする、新しいピペットで後退して交換することができます。 nAChRを神経生物学の文脈で説明しているが、この技術は、脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルや受容体の多くの種類を研究するための有用なはずである。

プロトコル

1。脳切片の調製と電気生理学のための溶液の調製

1. 脳スライスの準備のためのソリューションは、以前^3,4を記載した。 93 N-メチルD-グルカミン、2.5のKCl、1.2のNaH ₂ PO _4、30のNaHCO _3、20 HEPES、25：N-メチルD-グルカミン（NMDG）ベースの以下の組成の切断および復旧ソリューション（mm）を準備グルコース、5 Na ^+のアスコルビン酸塩、チオ尿素2、3 Na ^+のピルビン酸、硫酸マグネシウム10 _{4•7H 2} O 0.5のCaCl _{2•2H 2 O} NMDGで300から310 mOsmに調整してください。 10 N HClで7.3から7.4にpHを調整する。
   1. 各2Mの原液を作るためにミリポア水にし、MgSO _{4•7H 2} OおよびCaCl _{2•2H 2} Oに溶解する。
   2. 記載されているために、他の成分を秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、埋めるミリポア水でメスフラスコ。
   3. pHを測定し、10 N HClで調整してください。
   4. 浸透圧を測定し、必要に応じてNMDGで調整します。
2. 92のNaCl、2.5のKCl、1.2のNaH ₂ PO _4、30のNaHCO _3、20 HEPES、25グルコース、5のNa ⁺アスコルビン酸、2チオウレア、3 NA：以下の組成の人工脳脊髄液（ACSF）を（mMで）保持HEPESを準備⁺ピルビン酸、2し、MgSO _{4•7H 2} O 2のCaCl _{2•2H 2 O}スクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。
   1. 記載されている順序でコンポーネントを秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、ミリポア水でメスフラスコを埋める。
   2. pHを測定し、必要に応じてNaOHまたはHClで調整してください。
   3. 浸透圧を測定し、必要に応じて、スクロースで調整します。
3. 124のNaCl、KClを2.5、1.2のNaH ₂ PO _4、24のNaHCO _3、12.5グルコース、2し、MgSO _{4•7H 2} O 2のCaCl _{2•2H 2 O：}次の組成（mMで）の標準ACSF録音ソリューションを準備スクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。

2。急性脳スライスの調製

1. 脳切片の切断および復旧は^、前述の³と^4を行っています。 95％酸素/ 5％CO ₂ガス（carbogen）、氷上で1皿、33で他の℃までとリカバリソリューションをNMDGでいっぱい泡二つの結晶皿
2. バブル1水晶皿は室温でcarbogenとACSFを保持HEPESでいっぱい。
3. Na ^+のペントバルビタール（200 mg / kgを腹腔内）で成体マウス（2〜12ヶ月熟成）麻酔。動物がつま先ピンチへの応答を全く持っていないときの手順に進みます。
4. 必要に応じて、後でgenotypの末尾の組織サンプルをカット動物のING。
5. 胸腔を開いて心臓を露出し、下行大動脈をクランプします。右心房を裂く。
6. Transcardially 0〜4℃NMDGリカバリ·ソリューションの5〜10 mlの動物を灌流する。
7. 動物の首を、脳を除​​去し、1分間4℃NMDGリカバリ·ソリューションに配置します。
8. 氷のように冷えた金属板に、関心のある領域を含むように、所望の配向（等、水平、矢状、冠状）で脳をトリミング。
9. 接辞振動スライサーの乾燥ステージ表面に瞬間接着剤で脳ブロック（DSK-ゼロ1; Dosaka）、4水没脳ブロックcarbogenと℃のNMDGリカバリ·ソリューション、そして継続的にバブルソリューション。
10. 興味のある脳領域のスライ​​スをカット。スライスの厚さは、特定の興味のある脳領域、動物の年齢、および実行する実験に応じて、200〜400μmである。
11. すぐに切断後、carbogenatedで所望のスライス、33℃でインキュベートNMDG回復soluti正確に12分間で、その後60分の最初の期間のためのソリューションを保持carbogenated、室温のHEPESに転送されます。この60分間のインキュベーション後、スライスが記録のために使用することができます。スライスは、彼らがレコーディングに使用されるまで、一日を通して溶液を保持HEPESで維持されます。

3。脳スライスのニューロンからパッチクランプ記録

1. プログラマブル·フレイミング·ブラウンプラー（サターP-97または同等の垂直プラー）と標準パッチマイクロピペットを引き抜きます。ギガオームシールを形成するための最適なピペットは、典型的には4から6MΩの抵抗を持っている
2. 正立顕微鏡（ニコン、FN-1）のステージ上で、録音室（ワーナー·インスツルメンツのRC-27L）に1スライスを転送します。連続して表面かん流する（1.5 - 2.0ml /分）32℃に加熱され、維持carbogenated、標準記録ACSFとスライス℃の代わりに、スライスは室温に維持することができる。
3. 用いて、関心のある脳領域を見つけ、センター10X空気目標（ニコンプランフルーア10X、NA 0.3; WD：16ミリメートル）。
4. IR-微分干渉コントラスト（DIC）光学と赤外線電荷結合素子の近くに高速に接続40X近赤外（IR）の水浸対物レンズ（3.5ミリメートル;：; WD 0.80 NAニコンAPO 40XW）を使用して、個々の神経細胞を可視化する（CCD）ビデオカメラ（浜松ホトニクスC-7500）。 IR-DIC観察下で、健康なニューロンは滑らかで、明るい灰色の形質膜を示す。
5. 適切な細胞内記録液でマイクロピペットを埋める。 135カリウム、グルコン酸、5のEGTA、0.5 CaCl _2で 、2のMgCl _2、10 HEPES、2のMg-ATP、0.1 GTP（pHはトリス塩基、浸透圧で7.25に調整する：ほとんどのアプリケーションでは、我々は次のソリューション（mm）を使用290スクロースmOsm）に調整。可視化ニューロンからホールセル記録を確立します。

4。スライスのニューロンへの薬物のローカルアプリケーション

1. 上記のように標準のパッチクランプマイクロピペットを引き抜きます。使い方複数の薬剤溶液が同じセルで使用されるとき、例えば、ガラスの同じ部分からの2同一の "妹"のヒントを生成サッター、P-97などピペットプラーは有利である。それらは、上述の細胞内液を充填した場合MΩ〜5の抵抗を持っているでしょう先端サイズが最適です。
2. 埋め戻しcarbogenated、標準記録ACSFで希釈した薬剤の溶液でマイクロピペット。下向きの先端をポイントして、ソリューションの列に閉じ込められた気泡を除去するために薬剤を充填したマイクロピペットをはじく。
3. そのようなPicospritzerⅢ（総合バルブ株式会社）などの適切な圧力噴射システムにチューブで接続されたピペットホルダ内の薬物を充填したマイクロピペットをマウントしてください。ピペットホルダは、一般的にパッチクランプ記録（例えば、サッターMP-285）に使用されるマニピュレータと同じ分解能を持つマイクロマニピュレータに取り付けなければならない。また、マニピュレータはに、スライスのうち、斜め移動を考慮するべきです。マンually流体の列の後ろに十分な圧力を構​​築するために3〜4倍のマイクロピペットに圧力を取り出します。
4. IR-DIC光学の下に先端を可視化しながらマイクロマニピュレータのコントロールを使用して、スライスに薬物ピペットを下げる。理想的には、視覚的に識別し、センター前のスライスに記録マイクロピペットを下げる細胞近傍の薬物ピペットの位置決めが続くから記録されるニューロンがあります。薬物ピペットを合わせると、薬物ピペットがgigaohmシールを確立後に所定の位置に移動された場合は、記録が中断される可能性が記録された細胞の周辺に組織の動きを引き起こす可能性があります。
5. IRのビデオを使用して、組織切片の上面に薬物マイクロピペットを位置付ける。 1圧力駆とモニタ1）の排出に関連する破片の動きのための先端付近、及び先端が詰まっているかブロックされている兆候がないか2）マイクロピペットチップを実行します。先端がブロック/目詰まりしている場合は、pipettを撤回eと新しいものと交換してください。
6. このような最終的な位置に、薬剤を充填したピペットの先端が記録されたセルと記録電極の先端と同じ焦点面（またはそれより少し下）に）が1のとき、そのスライスの上部から斜めに記録されたセルに近づく記録されたセルから、2）は10〜40μm。薬剤を充填したピペットチップ、記録されたセルの上にある場合、圧力放出から力がgigaohmシールを混乱させる可能性があります。
7. 電圧クランプモードまたは電流クランプ·モードのセルを保持しつつ、所望の細胞応答を記録します。我々は日常的にアセチルコリンを記録および/または電圧クランプ·モードのニューロンを保持したまま、携帯電流をニコチン誘発した。 Picospritzer IIIを用いたときの圧力吐出が手動で起動することができますが、より再現性のある結果を得るためには、デジタルTTLパルスで取得システム（アクソンDigidata 1440とpClamp 10.3）を使用して圧力吐出をトリガすることをお勧めします。

5。制御圧電トランスレータを使用した薬剤を充填したマイクロピペット

1. 可能であれば、その後でアナログ電圧入力を受け入れることができる一次元圧電変換器（ 例えば Piezojena、PA-100またはバーレイPZM-150）（再び、アクイジション·システムから）、に薬物を充填したピペットホルダをマウント高精度マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）の上に取り付けられた。圧電トランスレータは入口/出口のタイミングや速度などのスライスの薬剤を充填したピペット内外への移動に便利ですので、より容易に制御、実験に実験から再生することができる。ピペットが圧力のみの吐出の瞬間のための圧電トランスレータを用いて細胞の近くに移動されたときnAChRsを勉強するとき、薬剤を充填したピペットからニコチン漏れの減感効果は、彼らがこれまで発生した場合、最小化されます。
2. 圧電電圧制御アンプ上で手動で制御されたポテンショメータを使用して、電圧をダイヤルその最大値に設定します。
3. マイクロマニピュレータ、ピペット位置が記録されたセルにその中身を取り出し、手動圧電電圧制御アンプ上ゼロに電圧を低減することによりピペットを撤回するスライスにおける薬剤を充填したピペットを用いて。
4. 記録収集システムからのアナログ出力信号を用いて、圧力吐出TTLパルスが発生する前に、300ミリ秒を開始する250ミリ秒の期間にわたってスライスに薬剤を充填したピペットを移動します。 TTLパルスの終了後50ミリ秒を開始し、250ミリ秒の期間にわたってピペットを収納してください。

結果

我々の実験では、我々は日常的にドーパミン（DA）産腹側被蓋野（VTA）と黒質緻密部（SNC）のニューロンをから記録します。電圧固定モードでは、これらの細胞にアセチルコリンやニコチンの圧力アプリケーションでは、通常100から200ミリ秒（ 図1A-B）内にピークに達した迅速、内向き陽イオン電流になります。電流の減衰は、主に作​​用部位からの薬物の拡散によって決定さ?...

ディスカッション

本論文で提示した方法は、脳スライス標本におけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するために広く便利です。しかし、かなりの実験データは、このメソッドを利用した結果としての品質と再現性に影響を与える要因がいくつかあります。例えば、誘発電流は、薬剤を充填したピペットの先端の直径に非常に敏感です。小さなヒントを吐出する薬液の難しさの原因となり、低抵抗?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-メチルD-グルカミン	シグマ	M2004
KClを	シグマ	P3911
のNaH 2 PO 4	シグマ	S9638
炭酸水素ナトリウム 3	シグマ	S6014
HEPES	シグマ	H3375
ブドウ糖	シグマ	G5767
NA +アスコルビン酸塩	シグマ	A4034
チオ尿素	シグマ	T8656
NA +ピルビン	シグマ	P2256
マグネシウム 4•7H 2 O	シグマ	230391
塩化カルシウム 2•2H 2 0	シグマ	223506
NaClを	シグマ	S9625
NA +ペントバルビタール	Vortech医薬品	76351315
グルコン酸カリウム	シグマ	G4500
EGTA	シグマ	E3889
のMg-ATP	シグマ	A9187
GTP	シグマ	G8877
テッド·ペラ社
P-97 /ブラウンマイクロピペットプラー燃える	サター
RC-27の録音室	ワーナー
TC-344B灌流ヒータコントローラ	ワーナー	640101
SH-27Bソリューションヒーター	ワーナー	640102
ニコンFN-1	ニコン
C-7500 CCDビデオカメラ	浜松
Picospritzer III	一般的なバルブ株式会社
MP-285マニピュレーター	サター
PA-100ピエゾトランスレータ	piezosystemイエナ株式会社
12V40ピエゾアンプ	piezosystemイエナ株式会社
Axopatch 200B	モレキュラーデバイス株式会社
Digidata 1440A	モレキュラーデバイス株式会社