Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Resumo

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Resumo

O uso do tabaco leva a inúmeros problemas de saúde, incluindo câncer, doenças cardíacas, enfisema e infarto. Vício de fumar cigarro é uma doença prevalente neuropsiquiátrica que decorre das ações biofísicas e celulares da nicotina sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em todo o sistema nervoso central. Compreender os subtipos nAChR vários que existem em áreas do cérebro importantes para a dependência da nicotina é uma das prioridades.

Experimentos que empregam técnicas de eletrofisiologia, como célula inteira braçadeira patch ou dois eletrodos gravações braçadeira de tensão são úteis para a caracterização farmacológica de nAChRs de interesse. Células que expressam nAChRs, tais como as células do tecido de mamífero de cultura ou oócitos de Xenopus laevis, são fisicamente isoladas e são, portanto, facilmente estudado usando as ferramentas da farmacologia moderna. Muito progresso foi feito utilizando essas técnicas, particularmente quando o receptor alvo, já era conhecido umª expressão ectópica foi facilmente alcançado. Muitas vezes, no entanto, é necessário estudar nAChRs no seu ambiente nativo: em neurónios dentro fatias de cérebro de forma aguda colhidas a partir de ratos de laboratório ou ratos. Por exemplo, os ratos que expressa "hipersensíveis" subunidades nAChR tais como α4 ratinhos e ratos L9'A ^um α6 L9 é ^2, permitir uma identificação inequívoca dos neurónios com base na sua expressão funcional de uma subunidade de nAChR específico. Apesar de célula inteira gravações remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro é feito rotineiramente pelo eletrofisiologista hábil, é um desafio para aplicar localmente drogas como a nicotina ou acetilcolina para a célula gravado dentro de uma fatia do cérebro. A diluição de drogas para os superfusate (aplicação do banho) não é rapidamente reversível, e tubo em U de sistemas não são facilmente adaptados para funcionar com fatias de cérebro.

Neste artigo, descrevemos um método para rapidamente aplicar nAChR drogas ativadoras de neurônios registrados em adultos mOuse fatias de cérebro. Padrão de célula inteira gravações são feitas a partir de neurónios em fatias, e uma segunda micropipeta cheia com uma droga de interesse é manipulado para a posição perto da célula registada. Uma injecção de ar comprimido ou de azoto inerte para a pipeta cheia de medicamento provoca uma pequena quantidade de solução de fármaco a ser ejectada a partir da pipeta da célula registada. Usando este método, nAChR mediadas correntes podem ser resolvidos com a precisão de milissegundos. Tempos de aplicação de drogas pode ser facilmente variada, e a pipeta cheia de medicamento pode ser recolhido e substituído por uma nova pipeta, permitindo curvas concentração-resposta para ser criado por um único neurónio. Embora tenha sido descrita no contexto de nAChR neurobiologia, esta técnica deverá ser útil para o estudo de muitos tipos de canais iónicos dependentes do ligando ou de receptores nos neurónios de fatias de cérebro.

Protocolo

1. Preparação de Soluções de Preparação Cérebro Slice e Eletrofisiologia

1. As soluções para a preparação de fatias de cérebro foram previamente descritos ^{3, 4.} Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG) baseada em corte e solução de recuperação com a seguinte composição (em mM): 93 N-metil D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 _de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 de Na ⁺ ascorbato, 2-tioureia, 3 piruvato de Na ^+, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ 2H ₂ O. • Ajuste para 300-310 mOsm com NMDG. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 10 N de HCl.
   1. Dissolver MgSO ₄ • 7H ₂ O, e CaCl ₂ 2H ₂ O • em água Millipore para fazer soluções de reserva 2 M de cada um.
   2. Pesar outros componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio com água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, preencherbalão volumétrico de água Millipore.
   3. Medir o pH e ajustar com 10 N de HCl.
   4. Medir a osmolaridade e ajustar com NMDG se necessário.
2. Prepare HEPES prendem fluido cerebrospinal artificial (aCSF) com a seguinte composição (em mM): NaCl 92, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 _NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 Na ⁺ ascorbato, 2, 3 de Na tioureia ⁺ piruvato, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH.
   1. Pesar os componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio de água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, encher balão volumétrico com água Millipore.
   2. Medir o pH e ajustar com NaOH ou HCl, se necessário.
   3. Medir e ajustar a osmolaridade com sacarose, se necessário.
3. Preparar a solução de gravação de padrão de aCSF a seguinte composição (em mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 O. NaH ₂ PO _4, 24 _de NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 2 CaCl ₂ 2H ₂ • Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH.

2. Preparação de fatias cerebral aguda

1. Corte fatia cerebral e de recuperação são realizados como anteriormente descrito ^{3, 4.} Pratos bolha cheia de dois cristais NMDG solução de recuperação com 95% de oxigénio / 5% de CO ₂ do gás (carbogénio), um prato em gelo, o outro a 33 ° C.
2. Bolha prato de cristal cheio de um HEPES segurando aCSF com carbogênio à temperatura ambiente.
3. Anestesiar rato adulto (com idades entre 2 a 12 meses) com pentobarbital de Na ⁺ (200 mg / kg, ip). Prossiga com o procedimento quando o animal não tem resposta a um dedo do pé pitada.
4. Se necessário, cortar uma amostra de tecido da cauda para posterior genotypção do animal.
5. Abrir a cavidade torácica, expor o coração, e prender a aorta descendente. Dilacerar o átrio direito.
6. Transcardially perfundir animal com 5-10 ml de 0-4 ° C uma solução de recuperação NMDG.
7. Decapitar animal, remover o cérebro e colocá-lo em solução de 4 ° C NMDG recuperação durante 1 min.
8. Sobre uma placa de metal em gelo refrigerados, aparar o cérebro na orientação desejada (coronal, parasagital, horizontal, etc), para incluir a área de interesse.
9. Apor o bloco de cérebro com supercola para a superfície de fase seca de um cortador de vibração (DSK-Zero 1; Dosaka), submergir o bloco cerebral em 4 ° C uma solução de recuperação de NMDG e continuamente a solução de bolha com carbogénio.
10. Cortar fatias de cérebro a área de interesse. Espessura de corte é 200-400 um, dependendo da área específica do cérebro de interesse, a idade do animal, e experimentar a ser executada.
11. Imediatamente após o corte, incubar fatias desejados em carbogenated, 33 ° C NMDG a recuperação solution durante exactamente 12 min, em seguida, transferir para carbogenated, HEPES a temperatura ambiente prendem solução durante um período inicial de 60 min. Após esta incubação de 60 min, as fatias pode ser utilizado para gravação. Fatias são mantidas em tampão HEPES prendem solução ao longo do dia, até que sejam utilizados para a gravação.

3. Gravação de remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro

1. Puxe uma micropipeta remendo padrão com uma programável Flaming-Brown extrator (Sutter P-97, ou puxador vertical, equivalente). Pipetas que são ideais para giga-ohm formação selo normalmente têm uma resistência de 4-6 MQ
2. Transferir uma fatia para a câmara de gravação (RC-27L; Instrumentos Warner) no palco de um microscópio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) a fatia com carbogenated, padrão de gravação aCSF aquecido e mantido a 32 ° C. Alternativamente, as fatias pode ser mantida à temperatura ambiente.
3. Localize e centro a área do cérebro de interesse usandoum objectivo ar 10X (Nikon Plano Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
4. Visualizar os neurónios individuais usando um 40X infravermelha (IR) objectiva de imersão em água (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) ligados a IR-contraste de interferência diferencial (DIC) e uma óptica de alta velocidade do infravermelho próximo Charged Coupled Device (CCD) da câmera de vídeo (Hamamatsu C-7500). Sob IR-DIC de observação, os neurônios saudáveis ​​apresentam uma superfície lisa, membrana plasmática cinza claro.
5. Encher uma micropipeta com uma solução de gravação adequado intracelular. Para a maioria das aplicações, que utilizam a solução seguinte (em mM): 135 Gluconato de potássio, 5 EGTA, 0,5 _CaCl2, 2 _de MgCl2, 10 mM de HEPES, 2 de Mg-ATP, GTP e 0,1 (pH ajustado a 7,25 com base Tris, osmolaridade ajustado para 290 mOsm com sacarose). Estabelecer uma gravação de células inteiras de um neurônio visualizado.

4. A aplicação local de medicamentos para Neurônios em fatias

1. Puxar uma micropipeta grampo padrão adesivo, como descrito acima. Usoum extractor de pipeta, tal como um Sutter P-97 que produz dois idênticos "irmãs" pontas da mesma peça de vidro é vantajoso quando as soluções de múltiplas drogas estão a ser utilizados na mesma célula. Tamanhos de ponta que tem uma resistência de ~ 5 MQ se eles foram preenchidos com a solução intracelular descritas acima são o ideal.
2. Backfill micropipeta o com uma solução de fármaco diluído em carbogenated aCSF gravação, padrão. Apontar a ponta para baixo, e agite a micropipeta e recheada de drogas para remover quaisquer bolhas de ar retidas na coluna de solução.
3. Montar a micropipeta e recheada de drogas num suporte de pipeta ligada com tubagem a um sistema adequado de pressão de ejecção, como um Picospritzer III (General Valve Co.). O titular da pipeta deve ser montado sobre um micromanipulador com a mesma resolução que manipuladores comumente utilizado para a gravação de fixação de membranas (por exemplo, Sutter MP-285). Além disso, o manipulador deve permitir o movimento diagonal para dentro e fora da fatia. Homemdualmente ejectar pressão 3 a 4 vezes para a micropipeta, a fim de construir-se uma pressão adequada por trás da coluna de líquido.
4. Usando os controles micromaniplador, abaixe a pipeta de drogas na fatia, enquanto visualiza a ponta sob IR-DIC óptica. Idealmente, deve-se identificar visualmente e centro de um neurónio para ser gravado a partir de, seguido pelo posicionamento da pipeta droga perto da célula antes de baixar a micropipeta de gravação para a fatia. Posicionar a pipeta de drogas podem causar o movimento do tecido na vizinhança da célula gravada que poderiam interromper a gravação se a pipeta de droga é movido para a sua posição depois de se estabelecer uma vedação gigaohm.
5. Usando vídeo IR, posicionar a micropipeta droga na superfície superior da fatia de tecido. Executar uma pressão de ejecção e do monitor 1) na proximidade da ponta para o movimento de detritos relacionados com a ejecção, e 2) a ponta micropipeta para detectar quaisquer sinais de que a ponta está obstruída ou bloqueada. Se a ponta está bloqueada / entupidos, recolha a pipetae e substituí-la por uma nova.
6. Abordagem a célula gravado na diagonal a partir do topo da fatia de tal modo que quando em posição final, a ponta da pipeta e recheada de drogas é 1) no mesmo plano focal (ou ligeiramente inferior) como a célula gravada e a ponta do eléctrodo de registo , e 2) de 10 a 40 um da célula registada. Se a droga-cheia ponta da pipeta está acima da célula gravada, a força da pressão de ejecção poderiam perturbar o selo gigaohm.
7. Registar a resposta celular desejado enquanto mantém a célula em modo de grampo de tensão ou de corrente de modo de fixação. Rotineiramente gravar acetilcolina e / ou nicotina provocou correntes de celulares, mantendo os neurônios no modo de fixação de voltagem. Embora a pressão de ejecção pode ser activado manualmente quando se utiliza um Picospritzer III, para resultados mais reprodutíveis, é aconselhável para provocar a ejecção de pressão através do sistema de aquisição (Axon Digidata 1440 e pClamp 10,3) com um TTL digital de pulso.

5. ControladorMicropipeta a Drug-cheia com um tradutor piezoelétrico

1. Se possível, montar o suporte de pipeta e recheada de drogas a um tradutor de dimensão única piezoeléctrica (por exemplo Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) que é capaz de aceitar uma entrada de tensão analógico (mais uma vez, a partir do sistema de aquisição), que é então montado sobre o micromanipulador de alta precisão (Sutter MP-285). Um tradutor piezoeléctrico é útil porque o movimento da pipeta e recheada de drogas para dentro e para fora da fatia, incluindo o tempo e a velocidade de entrada / saída, pode ser mais facilmente controlado e reproduzido de experiência para experiência. Ao estudar nAChRs, os efeitos de dessensibilização de vazamento de nicotina a partir da pipeta cheia de medicamento, deve ocorrer que alguma vez, são minimizadas quando a pipeta é movido apenas perto da célula com um tradutor piezoeléctrico para o momento de ejecção de pressão.
2. Através do potenciômetro controlado manualmente no amplificador de controle de tensão piezoelétrico, disque a tensãopara o seu valor máximo.
3. Usando o micromanipulador posição, a pipeta de droga-cheia na fatia onde a pipeta ejecta o seu conteúdo para a célula gravada, e retrair a pipeta manualmente, reduzindo a tensão para zero no amplificador piezoeléctrico tensão de controlo.
4. Utilizando um sinal de saída analógico do sistema de aquisição de gravação, mover a pipeta e recheada de drogas na fatia por um período de 250 mseg a partir de 300 ms antes do impulso de pressão de ejecção TTL ocorre. Retrair a pipeta durante um período de 250 mseg, a partir de 50 ms após o impulso TTL termina.

Resultados

Em nossos experimentos, nós rotineiramente gravar a partir de dopamina (DA) de produção de neurônios da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNc). Em tensão-grampo modo, a aplicação de pressão ou de acetilcolina nicotina para essas células normalmente resultam em uma rápida corrente de catiões, para o interior, que atinge o pico dentro de 100-200 mseg (Figura 1A-B). Decaimento da corrente é em grande medida ditada por difusão da droga a partir do local de acção ...

Discussão

O método apresentado neste artigo é de grande utilidade para o estudo de ligante fechado função de canal iônico em preparações fatia do cérebro. No entanto, há uma série de factores que irão afectar significativamente a qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais, que resultam da utilização deste método. Por exemplo, as correntes evocadas são muito sensíveis ao diâmetro da ponta da pipeta e recheada de drogas. Pequenas dicas irá causar dificuldade com esvaziando a solução de drogas, e dicas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-metil D-glucamina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glicose	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiouréia	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Gluconato de potássio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibratório slicer	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipeta extrator	Sutter
Câmara RC-27 Gravação	Warner
TC-344B controlador de aquecedor Perfusão	Warner	640101
SH-27B aquecedor Solução	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 câmera de vídeo CCD	Hamamatsu
Picospritzer III	Geral Valve Co.
Micromanipulador MP-285	Sutter
PA-100 tradutor piezoelétrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificador	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp