Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Özet

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Özet

Tütün kullanımı kanser, kalp hastalığı, amfizem, ve inme gibi birçok sağlık sorunlarına yol açar. Sigara bağımlılığı merkezi sinir sistemi boyunca nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) nikotinin biyofiziksel ve hücresel faaliyetler kaynaklanıyor yaygın bir nöropsikiyatrik bozukluktur. Nikotin bağımlılığı ile ilgili beyin bölgelerinde mevcut çeşitli nAChR alt anlamak önemli bir önceliktir.

Bu tür bütün-hücre yama klempi veya iki elektrotlu voltaj kelepçesi elektrofizyolojik kayıtları gibi teknikleri kullanan deneyler ilgi nAChRs farmakolojik karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür memeli doku kültürü hücreleri veya Xenopus laevis oosit olarak Hücreler ifade nAChRs, fiziksel olarak izole edilir ve bu nedenle kolayca modern farmakoloji araçları kullanılarak incelenmiştir. Hedef reseptör zaten bilinen, özellikle çok gelişme, bu teknikler kullanılarak yapılmış birnd ektopik ifade kolayca elde edildi. Akut laboratuar fareleri ya da sıçanlar hasat beyin kesitleri içinde nöronlarda: Ancak, çoğu zaman kendi doğal ortamında nAChRs incelemek için gereklidir. Örneğin, bu tür fareler α4 L9'A fareler ¹ ve α6 L9, ^2'S fareler gibi "duyarlı" nAChR alt üniteleri ifade eden, spesifik nAChR alt birim olan fonksiyonel ekspresyonu esas nöronların kesin tanımlanması için izin verir. Beyin dilimleri içerisinde nöronlardan gelen tüm-hücre yama klemp kayıtları rutin yetenekli elektrofizyolog tarafından yapılmasına rağmen, yerel olarak böyle asetilkolin veya bir beyin dilim içinde kaydedilen hücreye nikotin gibi ilaçların uygulamak zordur. Superfusate içine ilaçların seyreltilmesi (banyo uygulaması) hızla geri dönüşü yoktur, ve U-tüp sistemleri kolayca beyin dilimleri ile çalışmak için adapte değildir.

Bu yazıda, hızla yetişkin m Kaydedilen nöronlar nAChR-aktive edici ilaçları uygulamak için kullanılan bir yöntem tarifbeyin dilimleri Ouse. Standart tam hücre kayıtları dilimleri nöronların yapılır ve ilgi bir ilaç ile dolu ikinci bir mikropipet kaydedilen hücrenin yakınında pozisyon içine manevra edilir. Ilaç ile dolu pipet içine basınçlı hava, nitrojen veya inert bir enjeksiyon kaydedilmiş hücrenin üzerine pipetle çıkartılabilmesi için ilaç solüsyon bir miktar neden olur. Bu yöntemi kullanarak, nAChR-aracılı akımları milisaniyelik doğrulukla çözülecek edebiliyoruz. İlaç uygulama zamanları kolayca değiştirilebilir ve uyuşturucu dolu bir pipet konsantrasyon-cevap eğrileri tek bir nöron için oluşturulmuş olması için izin veren yeni bir pipet yardımıyla çekilerek değiştirilebilir. NAChR nörobiyolojide bağlamında tarif olmasına rağmen, bu yöntem beyin kesitleri nöronları içinde ligand-kapılı iyon kanalları ya da reseptörleri birçok türleri çalışmak için yararlı olacaktır.

Protokol

1. Beyin Dilim Hazırlama ve Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması

1. Beyin kesitleri hazırlanması için çözümler daha önce ^{3, 4} tarif edilmiştir. 93. N-metil D-glukamin, 2,5 KCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25: N-metil D-glukamin (NMDG)-tabanlı olarak aşağıdaki bileşime sahip bir kesme ve geri kazanım solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması glikoz, 5 Na ⁺ askorbat, 2 tioüre, 3 Na ⁺ piruvat, 10 _MgSO4 • 7H ₂ O, 0.5 _CaCl2 • 2H ₂ O. NMDG ile 300-310 mOsm ayarlayın. 10 N HCI ile 7,3-7,4 pH ayarlayın.
   1. Her 2 M stok çözeltiler için Millipore suda _MgSO4 • 7H ₂ O ve _CaCl2 • 2H ₂ O çözülür.
   2. Listelenen sırayla diğer bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her eklendikten sonra, dolguMillipore su ile ölçülü balonda.
   3. PH ölçün ve 10 N HCI ile ayarlayın.
   4. Osmolarite ölçün ve gerekirse NMDG ile ayarlayın.
2. 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glikoz, 5 Na ⁺ askorbat, 2 tioüre, 3 Na: aşağıdaki kompozisyonun yapay serebrospinal akışkan (aCSF) (mM), HEPES tutma hazırlanması ⁺ piruvat, 2 _MgSO4 • 7H ₂ O, 2 _CaCl2 • 2H ₂ O Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH'ı 7,3-7,4 için ayarlayın.
   1. Listelenen sırayla bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her şeyi bir kez eklendiğinde, Millipore su ile ölçülü balona doldurun.
   2. PH ölçün ve gerekirse NaOH veya HCl ile ayarlayın.
   3. Osmolarite ölçün ve sukroz Gerekirse ayarlayın.
3. 124 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH ₂ PO _4, 24 NaHCO _3, 12.5 glikoz, 2 _MgSO4 • ₂ 7H O, 2. _CaCl2 • 2H ₂ O.: Aşağıdaki bileşim standart aCSF kayıt solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH'ı 7,3-7,4 için ayarlayın.

2. Akut Beyin Dilimleri hazırlanması

1. Daha önce ^{3, 4} tarif edildiği gibi beyin dilim kesme ve geri kazanım yapılır. Kabarcık iki kristal yemekleri% 95 oksijen /% 5 CO ₂ gazı (carbogen), buz üzerinde bir tabak, 33 de diğer ° C ile kurtarma çözümü NMDG dolu
2. Kabarcık bir kristal çanak oda sıcaklığında carbogen ile aCSF tutma HEPES ile doldurulur.
3. Na ⁺ pentobarbital (200 mg / kg, ip) ile erişkin fare (2 ile 12 ay arası) uyuştur. Hayvan ayak tutam hiçbir yanıt olduğunda prosedürü ile devam edin.
4. Gerekirse, daha sonra genotip için bir kuyruk doku örneği kestihayvan ing.
5. Göğüs boşluğu açın, kalp maruz ve inen aorta klemp. Sağ atrium yaralamak.
6. Transkardiyal 0-4 ° C NMDG-kurtarma çözümü ile 5-10 ml hayvan serpmek.
7. Hayvan başını kesmek, beyin çıkarın ve 1 dakika süreyle 4 ° C NMDG-kurtarma çözümü yerleştirin.
8. Bir buz soğuk metal plaka üzerinde, ilgi alanına dahil etmek istediğiniz yönü (vb, yatay, parasagital, koronal) beyinde kırpın.
9. Eke titreşen bir dilimleyici ve kuru aşamasında yüzeye yapıştırıcı ile beyin blok (DSK-Zero 1; Dosaka), 4 daldırın beyin blok carbogen ile ° C NMDG-kurtarma çözümü ve sürekli kabarcık çözüm.
10. İlgi beyin bölgesinin dilimleri kesin. Dilim kalınlık özel bir ilgi alanı beyin, hayvan yaş, gerçekleştirilmesi için deney bağlı olarak 200-400 mikron.
11. Hemen kesim sonrası içinde inkübe istenen dilim, 33 carbogenated ° C NMDG-kurtarma solutitam 12 dakika boyunca, daha sonra 60 dakikalık bir başlangıç ​​dönemi için tutma carbogenated çözelti, oda sıcaklığında HEPES transfer. Bu 60 dakika inkübasyondan sonra, dilimler kayıt için de kullanılabilir. Dilimler bu kayıt için kullanılana kadar gün boyunca çözelti tutma HEPES içinde muhafaza edilir.

3. Beyin Dilimleri nöronlar Patch Clamp Kaydı

1. Bir programlanabilir Flaming-Kahverengi çektirmesi (Sutter P-97 veya eşdeğeri dikey çektirme) ile standart yama mikropipet çekin. Giga-ohm mühür oluşumu için optimum olan Pipetler genellikle MΩ 4-6 bir dirence sahiptir
2. Dik mikroskop (Nikon FN-1) sahnede; kayıt odasına (Warner Instruments RC-27L) bir dilim aktarın. Sürekli superfuse (1.5 - 2.0 ml / dk) 32 ısıtıldı ve muhafaza carbogenated, standart kayıt aCSF ile dilim ° C. Alternatif olarak, dilimler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
3. Kullanılarak ilgi beyin alan bulmak ve orta10X bir hava hedefi (Nikon Planı Fluor 10X, NA 0.3, WD: 16 mm).
4. 40X yakın kızılötesi (IR) su immersiyon objektif (;: 0.80; WD: NA Nikon APO 40XW 3,5 mm) kullanarak tek tek nöronların görselleştirin yakın kızılötesi IR-diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ve yüksek hızda bağlı birleştiğinde cihazı şarj (CCD) video kamera (Hamamatsu C-7500). IR-DIC gözlem altında, sağlıklı nöronların düzgün, açık gri plazma zarı sergilerler.
5. Uygun bir hücre içi kayıt solüsyonu ile bir mikropipet doldurun. 135 Potasyum glukonat, 5 EGTA, 0.5 CaCl _2, 2 _MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP ve 0,1 GTP (pH Tris baz, osmolarite ile 7,25 ayarlanabilir: Çoğu uygulama için, aşağıdaki çözüm (mM) kullanın 290 mOsm sakaroz ile) 'e ayarlanmıştır. Bir görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması.

4. Dilimler nöronlar için Uyuşturucu Yerel Uygulama

1. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir standart yama kelepçe mikropipet çekin. Kullanmaçoklu ilaç solüsyonları aynı hücre üzerinde kullanılmak üzere bu tür cam aynı parça iki özdeş "kardeş" uç üreten bir Sutter P-97 gibi bir pipet çekici avantajlıdır. Bunlar yukarıda tarif edilen hücre içi solüsyon ile dolduruldu eğer MΩ ila 5 arasında bir dirence sahip olacak meme çapları optimaldir.
2. Carbogenated, standart kayıt aCSF içinde sulandırılmış ilaç içeren bir çözelti ile Dolgu mikropipet. Aşağı ucu gelin ve çözüm sütununda sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için uyuşturucu dolu mikropipet fiske.
3. Böyle bir Picospritzer III (Genel Vana Co) gibi uygun bir basınç tahliye sistemine boru ile bağlanan bir pipet tutucu içinde ilaç ile dolu mikropipet monte edin. Manipülatör yaygın olarak (örneğin, Sutter MP-285) yama kelepçe kayıt için kullanılan pipet tutucu aynı çözünürlüğe sahip bir micromanipulator üzerine monte edilmelidir. Buna ek olarak, manipülatör içine ve dışına dilim çapraz hareket için izin vermelidir. Manmanuel bir sıvı kolon arkasında yeterli basınç oluşturmak için mikropipet içine basınç 3-4 kez çıkarır.
4. IR-DIC optik altında ucu görselleştirme ederken mikromanipülatör denetimlerini kullanarak, dilim içine ilaç pipet indirin. İdeal olarak, bir görsel olarak belirlemek ve merkez önce dilim içine kayıt mikropipet düşürülmesi için hücre yakın ilaç pipet konumlandırılması ardından gelen kaydedilmiş bir nöron için, olmalıdır. Ilaç pipet konumlandırılması ilaç pipet gigaohm bir mühür oluşturmak sonra konuma getirilir, kayıt bozabilir kaydedilmiş hücrenin çevresinde doku hareket etmesine neden olabilir.
5. IR video kullanılarak, doku dilim üst yüzeyinde ilaç mikropipet yerleştirin. Bir basınç ejeksiyon ve monitör 1) ejeksiyon ilgili enkaz hareketi için ucu çevresinde ve ucu tıkanmış veya bloke olduğuna dair herhangi bir işaret için 2) mikropipet ucu yürütün. Uç bloke / tıkanır ise, geri çekme pipette ve yenisi ile değiştirin.
6. Bu tür dilim üstünden çapraz olarak kaydedilmiş hücrenin yaklaşıma göre, son konumda, ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilen hücre ve kayıt elektrot ucu ile aynı odak düzlemi (ya da biraz altında) olarak) 1 iken ve 2) kaydedilmiş hücrenin 10-40 um. Ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilmiş hücrenin üzerine ise, basınç dışarı çıkmasıyla kuvvet gigaohm mühür bozabilir.
7. Gerilim kelepçe modu veya akım pensi modunda hücre tutarken istenilen hücresel yanıt kaydedin. Biz rutin asetilkolin kayıt ve / veya gerilim kelepçe modunda nöronlar tutarak cep akımları nikotin ortaya çıkardı. Bir Picospritzer III kullanırken basınç ejeksiyon elle tetiklenebilir rağmen, daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar için dijital TTL darbe ile toplama sistemi (Akson Digidata 1440 ve pClamp 10.3) kullanılarak basınç ejeksiyon tetiklemek için tavsiye edilir.

5. DenetlemeBir Piezoelektrik Translator ile İlaç dolu Mikropipet

1. Eğer mümkünse, bir tek-boyutlu piezoelektrik çevirmen uyuşturucu dolu pipet tutucu monte (örn. Piezojena PA-100 veya Burleigh PZM-150) sonra bir analog voltaj girişi (yine, edinim sistemi), kabul edebilir yüksek hassasiyetli mikromanipülatör (Sutter MP-285) üzerine monte. Uyuşturucu dolu pipet hareketin içine ve giriş / çıkış zamanlaması ve hızı gibi dilim, üzerinden daha kolay kontrol ve deneyden deneye yeniden olabilir çünkü piezoelektrik çevirmen yararlıdır. Pipet sadece basınç ejeksiyon an için bir piezoelektrik çevirmen ile hücre yakınında taşındığında nAChRs öğrenim görürken, uyuşturucu dolu pipetle nikotin kaçak desensitizan etkileri, onlar hiç gerçekleşmesi gerektiğini, minimize edilir.
2. Piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü elle kontrollü potansiyometre kullanarak, gerilim çevirmekmaksimal değeri.
3. Mikromanipülatör, pozisyon pipet Kaydedilen hücrenin üzerine içeriğini çıkarın ve elle piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü sıfır gerilimini düşürerek pipet çekilecektir dilim uyuşturucu dolu pipet kullanarak.
4. Kayıt toplama sistemi olan bir analog çıkış sinyali kullanılarak, 250 basınç tahliye TTL nabız msan meydana gelmeden önce 300 milisaniye başlayan bir süre boyunca kesit içine ilaç ile dolu pipet hareket eder. TTL puls sona erdikten sonra 50 msn başlayarak, 250 milisaniye boyunca pipet geri çekin.

Sonuçlar

Deneylerde, rutin dopamin (DA) üreten ventral tegmental alan (VTA) ve substantia nigra pars compactadaki (SNC) nöronlardan kaydedebilirsiniz. Voltaj-clamp modunda, asetilkolin veya bu hücrelere nikotin basınç uygulama tipik olarak 100-200 ms (Şekil 1A-B) dahilinde zirveye ulaştığı bir hızlı, içe doğru katyon akım neden olur. Mevcut bozulması büyük ölçüde etki bölgesinden ilacın difüzyon tarafından dikte edilir ve dilim enzimler mevcut olup olmadığı, bir inaktif biçim içine ...

Tartışmalar

Bu çalışmada sunulan yöntem, beyin dilim hazırlıkları ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için geniş yararlıdır. Bununla birlikte, önemli ölçüde deneysel veriler, bu yöntemi kullanarak gelen nihai ürünün kalitesi ve yeniden üretilebilirlik etkileyecek bir dizi faktör vardır. Örneğin, uyarılmış akımları ilaç ile dolu bir pipet ucu çapına karşı çok duyarlıdır. Küçük ipuçları ilaç solüsyonu ve düşük direnç ile büyük ipuçları kaydedilen hücre ve kayıt elekt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-metil D-glukamin	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glukoz	Sigma	G5767
Na + Askorbat	Sigma	A4034
Tiyoüre	Sigma	T8656
Na + Piruvat	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230.391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223.506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech İlaç	76351315
Potasyum glukonat	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 dilimleme Titreşimli	Ted Pella, Inc
P-97 Flaming / Brown mikropipet çektirmenin	Sutter
RC-27 Kayıt odası	Warner
TC-344B Perfüzyon ısıtıcı denetleyicisi	Warner	640101
SH-27B Çözüm ısıtıcı	Warner	640.102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD Video Kamera	Hamamatsu
Picospritzer III	Genel Valve Co
MP-285 Mikromanipülatör	Sutter
PA-100 Piezoelektrik tercümecisi	Piezosystem Jena, Inc
12V40 Piezo amplifikatör	Piezosystem Jena, Inc
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp