Method Article
وقد تجلى الدماغي الرصد لتحسين التروية الدقة في نماذج السكتة الدماغية. الصعوبات الفنية غالبا ما تحد من استخدام هذه الأداة الأساسية للبحث الدماغية. في هذا الفيديو، يظهر نظام الأمثل للحصول على الرصد واحدة أو متعددة خلال الدورة الدموية الموقع داخل اللمعة الأوسط انسداد الشريان الدماغي في الفئران.
إمكانية متعدية من البحوث ما قبل السريرية السكتة الدماغية تعتمد على دقة النمذجة التجريبية. الدماغي الرصد نضح في النماذج الحيوانية من السكتة الدماغية الحادة يسمح لتأكيد الانسداد الشرياني ناجحة وشاملة نزف تحت العنكبوتية. ويمكن أيضا رصد الدماغي نضح أن تستخدم لدراسة ضمانات التداول داخل الجمجمة، والتي تبرز كعامل محدد من نتائج قوية والسكتة الدماغية هدفا محتملا العلاجية. على الرغم من الدور المعترف به من رصد ليزر دوبلر نضح كجزء من المبادئ التوجيهية الحالية لنقص التروية الدماغية التجريبية، عددا من الصعوبات التقنية التي تحد من استخدامها موجودة على نطاق واسع. واحدة من القضايا الرئيسية والحصول على مرفق آمن وطويل الأمد لتحقيق اختراق عميق ليزر دوبلر في الجمجمة الحيوان. في هذا الفيديو، وتبين لنا نظامنا الأمثل لرصد التروية الدماغية العابرة خلال انسداد الشريان الدماغي الأوسط من خيوط داخل اللمعة في الفئران. وضعنا طن البيت طريقة بسيطة للحصول على حامل العرف المزدوج للألياف (في أعماق الاختراق) ليزر دوبلر تحقيقات، والتي تسمح في مواقع متعددة الرصد إذا لزم الأمر. يمكن بسهولة للرصد المستمر والمطول لنضح الدماغي يمكن الحصول على أكثر من الجمجمة سليمة.
البحث متعدية على عوامل التي تؤثر على الدورة الدموية والسكتة الدماغية والفيزيولوجيا المرضية العلاج يجب أن يتم تنفيذه، لأن هذه المسألة الهامة في كثير من الأحيان إهمال المفارقة من الدراسات البحثية الأساسية 1.
الدماغي الرصد نضح أداة أساسية، ولكن لا تستخدم بكثرة، لنمذجة دقيقة السكتة الدماغية 2. وبصرف النظر عن تأكيد انسداد الأوعية الشريانية والاستبعاد من نزيف تحت العنكبوتية 3، قد نضح المراقبة المستمرة الدماغي توفير بيانات مفيدة عن مدى اتساق والعجز التروية، والحالة الوظيفية للأوعية جانبية داخل الجمجمة وتأثير الدورة الدموية من النهج العلاجي الجديد.
دراسة حديثة تشير إلى مجموعتنا من يمكن استخدام الرصد أن الدورة الدموية في مواقع متعددة داخل الجمجمة لتقييم ضمانات التداول ويمكن التنبؤ حجم احتشاء والعجز وظيفية 4. هذه النتائج التجريبية هي و consiالدعامة مع الدراسات السريرية التي أظهرت أن الأداء الوظيفي للضمانات التداول الدماغي هو التنبؤية لنتائج السريرية في مرضى السكتة الدماغية الإقفارية 5، 6. لهذا السبب، تم الضمانات دعا الدماغية كهدف محتمل التداوي في المرحلة الحادة من 7 السكتة الدماغية.
الليزر دوبلر (LD) الصكوك هي أداة الأكثر شيوعا التي تستخدم لقياس التروية الدماغية السكتة الدماغية في التجريبية وينصح استخدامها من قبل الإرشادات الأخيرة حول هذا الموضوع 8. LD الصكوك نضح الاوعية الدموية الدقيقة في قياس حجم والقشرية الصغيرة، وعمق في الإشارات المسجلة كونها تعتمد على عرض الفصل الألياف، مع الألياف التوأم تحقيقات LD السماح لاختراق أعمق مقارنة مع واحد من الألياف تحقيقات LD 9. يتم التعبير عن القيم تدفق الدم وحدات نضح التعسفي (PU) والتي تشير إلى النسبية المطلقة بدلا من تدفق الدم إلى المخ. عادة ما يتم إجراء معايرة PU النقيبمعايير الحركة غرام، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. LD flowmetry يسمح المراقبة المستمرة الحيوية وتوليد البيانات الكمية في الدورة نفسها.
ومن بين المشاكل التقنية التي تحد حاليا استخدام LD، قضية رئيسية والحصول على مرفق آمن وطويل الأمد لتحقيق اختراق عميق ليزر دوبلر في الجمجمة الحيوان. هذا أمر ضروري لرصد طويلة وإذا تم استخدام مجسات متعددة لمختلف الأراضي الشرايين الدماغية، ونحن أداء في مختبرنا.
على وجه الخصوص، يتطلب وقتا الجراحية لفترات طويلة إذا تعلق تحقيقات في الجمجمة باستخدام مسامير أو ثقوب في الجمجمة لدغ، بينما إشارة الفقراء ومرفق غير آمن يحدث إذا تعلق الألياف واحد (منخفض الاختراق) تحقيقات LD في الجمجمة بواسطة الغراء الجراحية البسيطة. التوأم الألياف (اختراق عميق) تحقيقات LD توفير أعلى إشارة وأكثر اتساقا، لكنها أكبر من الألياف واحد وتحقيقات لا يمكن أن يكون فيtached في الجمجمة باستخدام الغراء الجراحية فقط.
في هذا الفيديو، وتبين لنا نظامنا الأمثل لرصد التروية الدماغية العابرة خلال انسداد الشريان الدماغي الأوسط من خيوط داخل اللمعة في الفئران. وصفنا طريقة بسيطة للحصول على، والعرف الصنع كفاءة، حامل منخفضة التكلفة لواحد أو عدة المزدوج الألياف (اختراق عميق) تحقيقات LD، لاستخدامها في رصد التروية الدماغية طويلة من خلال الجمجمة سليمة.
يمكن أن ينظر إلى عملية جراحية لMCAO عابر في الفئران في المادة عن طريق الفيديو من Uluç وزملاء العمل 10 و لا يظهر في هذا الفيديو.
1. كيفية جعل حامل دقق (موقع واحد أو مواقع متعددة)
2. إعداد سابق للجراحة
3. والتحقيق لتحديد المواقع تأمين أكثر من الجمجمة سليمة
4. رصد الإرواء الدماغي خلال MCAO
5. إزالة دقق (ق) ودقق حامل
6. رعاية ما بعد الجراحة
كان المستحث MCAO عابر (60 دقيقة) عن طريق إدراج خيوط السيليكون مغلف بالمطاط في الشريان السباتي الخارجي. وقد دفعت بعد ذلك حتى نهاية خيوط من محطة الشريان السباتي الداخلي حتى أصل MCA، تحت مراقبة LD. والمغطي عابر الشريان السباتي المشترك والشريان pterygopalatin خلال الإدراج الجراحي للخيوط. ويرد التمثيل التخطيطي لعملية جراحية في الشكل 1A.
تم اختيار إحداثيات الجمجمة لكي يتبوأ تحقيقين LD فقا لالأرض الشرياني الأساسي. وأظهرت التجارب الأولية مع رذاذ الحبر الجيلاتين (1B الشكل) أنه من المتوقع أن الدماغية الأساسية في إقليم MCA المركزية (bregma مم -1، 5 مم من خط الوسط، دقق 1)، في حين يتوقع تدفق ضمانات في إقليم borderzone بين القشرية الدماغية فروع الشرايين المتوسطة والأمامية (bregma +2 مم، 2 مم من خط الوسط، دقق 2).
ديناميكا الدم الدماغي تمت دراسة استخدام الليزر في مواقع متعددة تحقيقات دوبلر خلال كامل فترة العملية الجراحية، قبل أي وأثناء وبعد MCAO (الشكل 2). وكان العجز التروية الدماغية خلال MCAO أصغر حجما وأظهر درجة أعلى من التباين في دقق 2 مقارنة دقق 1، مما يدل بين الفروق الفردية في الأداء الوظيفي للضمانات داخل الجمجمة تحت ظروف الدماغية. موقع متعدد رصد دوبلر الليزر يسمح أيضا لدراسة التغيرات الدماغية خلال الدورة الدموية انسداد الشرايين خارج الجمجمة القريبة الدماغي (الشريان السباتي المشترك، الشريان السباتي الداخلي، الشريان pterygopalatin).
تم تقييم نتائج السكتة الدماغية 24 ساعة بعد ضخه من حيث الحجم احتشاء، وتحسب على التوالي في 19 أقسام ملطخة البنفسجي الكريزيل (الشكل 3)، وغارسيا وظيفية neuroscore 11. المناعية لأسو علامات محددةتم إجراء ciated مع إصابات الدماغ الدماغية، من أجل الحصول على التوزيع الطبوغرافية من فقدان الخلايا العصبية (بروتين يرتبط أنيبيب 2، MAP2) وشبه الظل الدماغية (الصدمة الحرارية من البروتين-70، HSP70) فيما يتعلق رصد في مواقع متعددة داخل الجمجمة الدورة الدموية من التداول (الشكل 4).
الشكل 1. الدماغي الرصد خلال نضح MCAO داخل اللمعة في الفئران. A. تمثيل تخطيطي العملية الجراحية لMCAO عابرة. واستخدم خيوط السيليكون المغلفة لتسد أصل MCA، بعد أن أدخلت في الشريان السباتي الخارجي ودفعت من خلال الشريان السباتي الداخلي. وligated إما الشرايين عنق الرحم القريبة (الشريان السباتي الخارجي) أو المغطي عابر (الشريان pterygopalatin والشريان السباتي المشترك) خلال اإلجراءاتويرد dure. B. A الدماغ ممثل الجيلاتين بعد تلطيخ الحبر. أجريت نضح Transcardiac من الجيلاتين الحبر حل 60 دقيقة بعد ظهور نقص التروية، دون ضخه. كانت ملطخة الدماغ perfused عادة الحبر الجيلاتين، وبدا كما الملونة الرمادي مع الأسود الملون السفن، في حين أن المنطقة الدماغية (NOT-perfused) ظلت غير ملوثين (الوردي اللون). وتظهر إحداثيات الجمجمة لكي يتبوأ تحقيقين LD. التحقيق 1 = مم -1 من bregma، 5 مم من خط الوسط، دقق 2 = +2 مم من bregma، 2 مم من خط الوسط.
الشكل 2. تسجيلات الدورة الدموية الدماغية باستخدام الليزر في مواقع متعددة تحقيقات دوبلر. ويرد نمط نموذجي الدورة الدموية داخل الجمجمة مما يوحي الضمانات الفعالة وظيفيا في ظل ظروف الدماغية. في هذا الحيوان، وأظهرت اقتفاء أثر LD صغيرةإيه العجز نضح في القناة 2 دقق، مقارنة للتحقيق 1 قناة، خلال انسداد CCA كل وانسداد MCA. MCA-O = انسداد الشريان الدماغي الأوسط. CCA-O = انسداد الشريان السباتي المشترك. وحدات PU = نضح.
الشكل 3. تم إصلاحها في بارافورمالدهيد 4٪ والملون مع البنفسجي الكريزيل 0.1٪ أقسام الدماغ ممثل لحساب حجم احتشاء أقسام نسيجية الاكليلية (+2.5 ملم إلى bregma -3،0 مم 50 ميكرومتر؛، ن = 19 ميكرومتر مع فاصل 250). يتم حساب حجم احتشاء باستخدام يماغيج برامج معالجة الصور، لتصحيح الاختلالات بين نصف الكرة الأرضية بسبب الوذمة الدماغية، وأعرب في مم 3. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية
الشكل 4. المناعية الواسمات الجزيئية لفقدان الخلايا العصبية وشبه الظل وتظهر الممثل أقسام الدماغ على التوالي، والتي كانت ملطخة البنفسجي الكريزيل 0.1٪ (A) أو immunostained مع علامات فقدان الخلايا العصبية (بروتين يرتبط أنيبيب 2، MAP2؛ B). وشبه الظل الدماغية (الحرارة صدمة البروتين-70، HSP70؛ C).
وضعنا في منزل نظام بسيط ومنخفض التكلفة لمرفق آمن واحد أو متعددة الألياف المزدوج (اختراق عميق) تحقيقات LD في الجمجمة سليمة من الفئران أثناء إجراء MCAO. وإن كان على ما يبدو مشكلة تافهة، والحصول على المرفقات موثوق بها لجنة التحقيق LD في الجمجمة هو في الواقع قضية رئيسية في هذا الإعداد التجريبية، لأنه هو شرط أساسي لكشف إشارة على نحو سلس وناجح للرصد من نضح الدماغي.
إجراءات الغازية، مثل الثقوب لدغ ومسامير العظام، وإطالة الوقت عادة الجراحية وإدخال متغيرات أكثر تجريبية تتعلق حج القحف، وهذا يمكن أن تثبط الباحثين والامتناع عن استخدام LD لهم الرصد. من ناحية أخرى، واستخدام الألياف واحد (اختراق الأقل) تحقيقات، والتي هي أرق وأسهل نسبيا ليتم لصقها مباشرة إلى سطح الجمجمة، ويعطي المنخفضة جودة الإشارة والتي لا يمكن استخدامها بشكل موثوق مع الفئران الكبار دون حفر أو ترقق الجمجمة.
استخدمنا مواد بسيطة ومنخفضة التكلفة، مثل المطاط الطبيعي، وأنابيب بلاستيكية ومعدنية مرود. يمكن أن تنتج A حامل التحقيق حسب الطلب في غضون دقائق قليلة، وتكييفها وفقا لظروف تجريبية. يمكن لهذه أصحاب التحقيق استيعاب واحد أو أكثر في أعماق الاختراق تحقيقات LD، لرصد الكلاسيكية موقع واحد على جوهر الدماغية أو متعدد رصد موقع في الأراضي الشرياني مختلفة في نصف الكرة نفسه أو عبر نصفي الكرة الأرضية. يمكن أن تنتج العديد من أصحاب التحقيق، تعقيم كيميائيا، وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. يتم استخدام الغراء البيطرية التي وافق عليها الجراحية (cyanoacrilate)، تسارع من الهواء البارد، لإرفاق صاحب التحقيق إلى السطح من الجمجمة سليمة الفئران، وفقا لإحداثيات الجمجمة المطلوب. وأخيرا، يتم تأمين مزيد من التحقيق انشاء وضعتها خيوط مشتركة.
الوقت العام لهذا التحقيق LD انشاء، بعد اتقان هذه التقنية، هو حوالي 10 دقيقة.
كما هو موضح طن هذا الفيديو، ونحن مراقبة روتينية التروية الدماغية في إقليم MCA المركزية (LD التحقيق 1: الأساسية الدماغية) وMCA في إقليم الطرفية (LD التحقيق 2: أساسا منطقة الناقص). في دراستنا الأخيرة أظهرت لنا أن تقلب التغيرات في تدفق الدم التحقيق LD 2 (يعني ± 52٪ 16٪ SD، بالمقارنة مع خط الأساس) أعلى بالمقارنة مع التحقيق LD 1 (يعني 31٪ ± 6٪ SD، مقارنة مع ويمكن استخدام خط الأساس) والسكتة الدماغية 4 للتنبؤ النتائج.
وقد تقدم بعض النصائح حل المشاكل للباحثين التي ترغب في استخدام لدينا في منزل نظام المتقدمة. في بداية التجربة، وتوخي الحذر لتجف بشكل جيد للغاية على سطح الجمجمة (مع ميربرومين والهواء البارد) قبل إرفاق صاحب التحقيق لمنع انفصال سابق لأوانه. وعلاوة على ذلك، يجب التأكد من تطبيق الغراء على المطاط الطبيعي، وتجنب الاتصال مع نهاية مفتوحة للأنبوب من البلاستيك والسطح البصري للتحقيق LD، لمنع إشارة الفقراء واحتمال حدوث تلف في التحقيق. عندما ربط الخيط حول الرأس من الحيوان، وتوخي الحذر من أجل تجنب انسداد مجرى الهواء (يتم منع هذا عن طريق وضع الخيط على العظام الفك السفلي). بعد تحديد المواقع وتأمين تحقيقات، يجب الحرص على عدم جر الكابلات التحقيق عندما تحول هذا الحيوان في موقف ضعيف لجراحة سرطان عنق الرحم، وهذا عادة ما يتطلب خطوة شخصين، شخص واحد يمسك الحيوان والشخص الثاني عقد الكابلات التحقيق وتحديد المواقع بلطف لهم إلى الموضع المطلوب. وأخيرا، تتم إدارة التلوث بسهولة في نهاية المطاف دم التحقيق LD المزدوج الألياف اتباع الإرشادات المقدمة تنظيف من قبل الشركة المصنعة.
يمكن أن نظامنا الأمثل لرصد التروية الدماغية، كما هو مبين في هذا الفيديو، وتوفير بديل أسهل، أسرع وأكثر موثوقية للتحقيق انشاء نظم التي تباع حاليا من قبل الشركات التجارية في هذا المجال. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن استخدام هذا النظام من قبل الباحثين الآخرين قد يعزز مسمارذ من ديناميكا الدم الدماغي في حقل السكتة الدماغية التجريبية، مما أدى إلى تطوير جيل جديد من العلاجات الجانبية الدماغي.
وقدمت التمويل لإنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو من قبل مور الصكوك المحدودة (اكسمينستر، ديفون، المملكة المتحدة)، التي تنتج ليزر دوبلر الصكوك هو مبين في دراستنا التجريبية.
تمت الموافقة على بروتوكول تجريبي لجنة رعاية الحيوان من جامعة ميلانو بيكوكا، وفقا لمبادئ توجيهية وطنية بشأن استخدام الحيوانات المختبرية (DL 116/1992) وتوجيه الاتحاد الأوروبي للتجارب الحيوانية (2010/63/EU )، بموجب ترخيص المشروع (ن 219/2011-B) من وزارة الصحة الإيطالية.
السيدة كارولين نشكر روبرتسون لأكثر من صوت والسيدة ايلينا بيروفانو لمساعدتها في إنتاج الفيديو. وأيد هذه الدراسة من جامعة ميلانو بيكوكا "Fondo دي أتينيو 2011".
Name | Company | Catalog Number | Comments |
معدات | |||
MoorVMS-2-LDF قناة ليزر دوبلر مراقب | مور الصكوك | ||
VP12 التحقيق | مور الصكوك | ||
كاشف / المواد | |||
Doccol حجم خيوط السيليكون المغلفة 4-0، قطر مع 0.39mm الطلاء | شركة Doccol | 403956PK10 | |
المطاط الطبيعي، على سبيل المثال المشتركة اللهايات لحديثي الولادة | متعددالموردون | ||
مرود المعادن، على سبيل المثال من إبرة في العمود الفقري مم X 18 90 GA | متعددة الموردين | ||
البلاستيك أنابيب، على سبيل المثال من الوريد المحددة لمم ضخ GA 25 20 X | متعددة الموردين | ||
خيط لايمتص أو مطلية أو الحرير مضفر | متعددة الموردين | ||
الجراحية الغراء CYANOACRYLATE | متعددة الموردين | ||
Isoflurane (100٪ V / V) للاستخدام البيطري | متعددة الموردين |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved