腔内中大脳動脈閉塞のラット脳卒中モデルにおける脳血流モニタリングのための最適化されたシステム

要約

脳血流モニタリングは虚血性脳梗塞モデルの精度を向上することが実証されている。技術的な問題は、多くの場合、脳血管研究のためのこの必要不可欠なツールの使用を制限します。このビデオでは、最適化されたシステムは、ラットにおいて腔内中大脳動脈閉塞時の単一またはマルチサイトの血行動態モニタリングを得ることが示されている。

要約

前臨床脳卒中の研究の翻訳可能性が実験的モデリングの精度に依存します。急性虚血性脳卒中の動物モデルにおける脳灌流の監視が成功した動脈閉塞を確認し、くも膜下出血を除外することができます。脳血流モニタリングも脳卒中転帰の強力な決定因子と考えられる治療標的として浮上している頭蓋側副血行を研究するために使用することができます。実験的脳虚血のための現在のガイドラインの一部としてレーザードップラー血流モニタリングの認識された役割にもかかわらず、技術的な問題の数は、その広範な使用を制限することがあります。主要な問題の一つは、動物の頭蓋骨に深く浸透レーザードップラープローブを安全にかつ長期添付ファイルを取得している。このビデオでは、我々は、ラットにおいて腔内フィラメントによる過渡中大脳動脈閉塞時の脳血流モニタリングのための私達の最適化されたシステムを示しています。我々は、私が開発N-ハウス、必要に応じて、マルチサイトの監視を可能にする（深い浸透）ツインファイバーレーザードップラープローブのためのカスタムメイドのホルダーを取得するための簡単​​な方法。脳灌流を継続的かつ長期のモニタリングが簡単に無傷の頭蓋骨を介して得ることができた。

概要

この重要な問題は、多くの場合、逆説的に基礎研究¹によって無視されているのでストローク病態と治療に影響を及ぼす血行動態因子に関するトランスレーショナル·リサーチは、実装する必要があります。

脳血流モニタリングは正確な虚血性脳卒中のモデリング²の、本質的な、しかし十分に活用されていないツールです。さておき、くも膜下出血³の動脈血管閉塞と排除の確認から、連続的な脳灌流モニタリングは灌流欠損、頭蓋副血管の機能の状態と新しい治療法の血行力学的効果の度合いと一貫性に関する有用なデータを提供することができる。

当社グループからの最近の研究では、マルチサイト血行動態モニタリングは頭蓋側副循環を評価するために、梗塞サイズと機能的な赤字^4を予測^すること^ができます使用することができることを示します。これらの実験結果はconsiアール大脳の側副血行路の機能性能は、虚血性脳卒中患者^5、6の臨床転帰を予測することが示された臨床試験のステント。このような理由から、脳血行が虚血性脳卒中の⁷の急性期における潜在的な治療ターゲットとして提唱されてきた。

レーザードップラー（LD）の楽器は、実験的虚血性脳卒中およびその使用は、このテーマ⁸についての最近のガイドラインで推奨されている中で脳血流を測定するために使用される最も一般的なツールである。小さ ​​な皮質体積のLD楽器対策微小血管灌流、単繊維のLDプローブ⁹に比べてより深い浸透を可能にするツインファイバーLDのプローブと、繊維分離の幅に依存している記録された信号の深さ。血流値は相対ではなく絶対的な脳血流量を示す任意の灌流ユニット（PU）のように表される。 PUのキャリブレーションは、通常usinを​​行っているグラムの運動基準、製造元の指示に従って。 LDの流量測定は、同一セッション内で連続ダイナミックモニタリングと定量的なデータを生成できます。

現在LDの使用を制限する技術的な問題の中でも、主要な問題は、動物の頭蓋骨に深く浸透レーザードップラープローブを安全かつ長期間の添付ファイルを取得している。我々は、我々の研究室で行っているので、これは、長期モニタリングのために不可欠であり、複数のプローブは、異なる脳動脈領土に使用されている場合。

プローブはバリ穴や頭蓋のネジを使用して、頭蓋骨に接続されている場合、単繊維（低浸透）LDプローブは単純な外科的な接着剤で頭蓋骨に接続されている場合、劣悪な信号およびセキュリティで保護されていない添付ファイルが発生したのに対し、具体的には、長時間手術時間が、必要とされる。ツインファイバー（深浸透）LDのプローブは、より高く、より一貫性のある信号を提供しますが、それらは単一のファイバープローブより大きく、であってはなりません唯一の外科的接着剤を使用して頭蓋骨にtached。

このビデオでは、我々は、ラットにおいて腔内フィラメントによる過渡中大脳動脈閉塞時の脳血流モニタリングのための私達の最適化されたシステムを示しています。私たちは無傷の頭蓋骨の上脳血流の長期モニターに使用される単一または複数のツインファイバー（深浸透）するための効率的な、カスタムメイド、低コストホルダーLDのプローブを得るために簡単な方法を説明します。

ラットにおける一過MCAOための外科的処置はUluçと同僚¹⁰でビデオの記事で見ることができ、このビデオには表示されません。

プロトコル

1。プローブ·ホルダー（単一サイトまたはマルチサイト）を作成する方法

1. 必要な材料は、天然ゴム、小さなプラスチック製の管及び金属スタイです。プローブホルダは、動物の大きさ、レーザードップラープローブの数とサイズ、および監視する必要がある脳血管領域にカスタマイズすることができます。
2. 必要なサイズ（約10ミリメートル300グラムのラットのx 10ミリメートル）の天然ゴムをカット。
3. 希望の定位座標に応じて、プローブ（s）と天然ゴムでブレグマの位置に印を付け、中大脳動脈閉塞のために、虚血中心部の典型的な座標はブレグマ-1ミリメートル、横方向に5mmに期待されている正中線は、末梢虚血性borderzoneの領土のために、予想される座標はブレグマ2ミリメートル、正中線の横2mmとすることができます。
4. 非常に明確にXが付いてブレグマの位置に印をつけ、これが頭蓋骨にプローブホルダーを取り付けるためのランドマークとなっています。
5. 小さなプラスチック製のチューブ（そのサイズはプローブのサイズと一致する必要があります）にスタイレットを挿入します。
6. プローブが配置されなければならない時点で天然ゴムにスタイレットを挿入し、プラスチックチューブがあまりにもゴムに挿入されるまでゴムにスタイレットを押してください。
7. スタイレットを撤回。
8. 複数のプローブが必要な場合は、他のプローブの位置については1.5から1.7の手順を繰り返します。
9. 複数のプローブ用のオプション：プローブの優れた安定性を確保するためにプラスチックチューブの周りにテープを巻きつけます。
10. オプション：将来の使用のためのいくつかのプローブホルダの化学的殺菌を行う。

2。術前準備

1. MCAOストロークモデルは通常、生存手術として行われます。 （生存時間24時間の手術後）、私たちのビデオに示すように、このケースでは、外科医は、滅菌器や物資を無菌技術を使用しています。
2. イソフルラン（3％inductioラットを麻酔N相、1.5％の維持）。
3. 手術台の上にうつ伏せにラットを配置します。
4. そっとネズミの頭を剃る。
5. ガーゼに消毒液を塗布し、皮膚の消毒。
6. 頭蓋領域内/ kgの皮下に2パーセントを5mgリドカイン投与。

3。無傷スカルオーバープローブ位置決めと保護

1. 右正中皮膚切開（右MCAO）を作り、頭蓋筋膜（ 帽状腱膜 ） に到達するために皮下組織を切開する。
2. 頭蓋筋膜で右正中切開を行い、頭蓋骨に到達する鈍的切開を行い、プローブホルダのアプリケーションのための十分な大きさの頭蓋骨の骨領域を準備します。
3. 予めご了承くださいませ。掘削や間伐骨の必要性を全く。
4. 頭蓋骨の表面を消毒し、乾燥さメルブロミンソリューションを適用します。
5. 頭蓋骨の表面を乾燥を促進するためにヘアドライヤー（冷気に設定）を使用します。
6. この時点では、頭蓋縫合とブレグマがはっきりとわかります。
7. 滅菌ハサミで縁を切断することにより、プローブホルダーをカスタマイズします。
8. 慎重にプラスチックチューブの下方開口部を（注意回避プローブホルダーの下表面に外科糊を少量（獣医認定のシアノアクリレート）を適用します：接着剤、かなりの量の光プローブの表面との間に残っている場合頭蓋骨は、この）は、低信号を生成することができるし、複数の用途で使用した後、プローブを損傷することがあります。
9. 慎重にXのランドマークとブレグママッチング、頭蓋骨の表面にプローブホルダーを適用します。プローブホルダ上穏やかな圧力を適用します。
10. 手術接着剤を乾燥を促進するためにヘアドライヤー（冷気に設定）を使用します。
11. プローブホルダや動物の頭の周りの手術糸を結ぶことによって、プローブホルダーを固定します。下顎骨の上に手術糸を配置するように注意して、顎下の領域と目を避ける電子ネック。
12. オプション：光ゲル（共通音波や心電図ゲルなど ）とプローブホルダのプラスチックチューブ（複数可）を記入し、これはLD信号の品質が向上します。
13. プローブホルダーにプローブを配置し、LDの流量計の実際の測定値を確認します。製造元の指示に従って、LDの流量計を使用しています。
14. 動物の頭の周りにそれらを結ぶプローブ（s）を安全に保管すること。顎下部と首を避けて、下顎骨の上に手術糸を配置するように注意してください。

4。 MCAO中脳灌流監視

1. 慎重にプローブ（s）またはプローブホルダに牽引力を避けて、仰臥位でラットを置きます。
2. MCAO中脳灌流監視を開始します。

5。プローブ（s）とプローブ·ホルダーの取り外し

1. プローブ（S）、プローブホルダや動物の頭の周りに糸をカットします。
2. 優しくプローブホルダの天然ゴムベースの周り頭蓋軟部組織および皮膚を切開鈍らせる。
3. プローブホルダーを外します。
4. 頭蓋骨の表面に消毒液を適用します。
5. 頭蓋皮膚を縫合する。

6。術後のケア

1. 皮下に脱水を防ぎ、ガス麻酔を停止した後、加熱パッドを用いた動物暖かいを維持するための生理食塩溶液2.5mlを管理します。
2. 生存手術のために：皮下ケトプロフェン4 mg / kgので先制鎮痛を提供し、12時間の手術後に同じ用量を繰り返す
3. 我々の実験条件下では、安楽死は、CO ₂吸入により24時間後の手術で行われました。

結果

過渡MCAO（60分）は外頸動脈におけるシリコーンコートフィラメントを挿入することによって誘発された。フィラメントは、その後、LDの監視の下で、MCAの原点に内頸動脈末端を通して押し上げた。総頸動脈とpterygopalatin動脈を一過性フィラメントの外科的挿入中に吸蔵された。外科手術の概略図を図1Aに示す。

2 LDのプローブを位置決めするための頭蓋座標は、基礎となる動脈領域に応じて選ばれた。担保の流れが間にborderzone領土で期待されている間、;ゼラチンインク灌流による予備実験では、（ 図1B）、虚血性コアは、中央MCAの領土（プローブ1ブレグマ-1ミリメートル、正中線から5mm）に期待されていることを示したミドルと前大脳動脈の皮質枝（ブレグマ2ミリメートル、正中線から2ミリメートル;プローブ2）。

脳の血行動態はMCAO（ 図2）の間と後に、 すなわち前に、外科手術の全期間中、マルチサイトレーザードップラープローブを用いて検討した。 MCAO時の脳灌流赤字が小さくなったとプローブ1に比べプローブ2の変動度が高いことを示し、虚血条件下で頭蓋担保の機能性能の個人間の違いを示唆している。マルチサイトレーザードップラーモニターはまた、近頭蓋外脳動脈（総頚動脈、内頚動脈、pterygopalatin動脈）の閉塞時の脳血行動態の変化を研究することができます。

脳卒中転帰は、クレシルバイオレット（ 図3）、ガルシア機能neuroscore ¹¹で染色した19の連続したセクションで計算、梗塞体積によって再灌流24時間後に評価した。特異的なマーカーASSOの免疫組織化学虚血性脳損傷とciatedは頭蓋内循環のマルチサイト血行動態モニタリングに関連して、神経細胞の損失（タンパク質2、MAP2を微小管関連）と虚血性半影（熱ショック蛋白質70、HSP70）の地形分布を得るためには、実行された（ 図4）。

図1。ラットにおける腔内MCAO中の脳血流モニタリング。過渡MCAOための外科的処置のAの概略図。シリコーンコートフィラメントは外頸動脈に導入され、内頸動脈を介してプッシュされた後、MCAの起点を閉塞させるために使用されていました。近子宮頸動脈どちらライゲーション（外頸動脈）またはproce時（pterygopalatin動脈と総頚動脈）一過性に閉塞したdure。B.描写脳を、ゼラチンインク染色後に表示されます。ゼラチンインク溶液の経心臓的灌流灌流せずに、60分虚血の発症後に行われた。通常、脳灌流を、ゼラチンインクで染色し、虚血性（ない灌流）領域が染色されていないままであった（ピンク色）、黒ステンド船舶とグレー色として登場しました。 2 LDのプローブを位置決めするための頭蓋座標が表示されます。プローブ1ブレグマから= -1ミリメートル、正中線から5mm、プローブ2 =ブレグマ、正中線から2ミリメートルから2ミリメートル。

図2。マルチサイトレーザードップラープローブを用いた脳血流力学的録音。虚血条件下で機能的に活性な頭蓋内血行を示唆している典型的な血行動態のパターンが示されています。この動物では、LDトレーシングは小さいが認められCCAの閉塞およびMCA閉塞の両方の間に、1チャネルをプローブと比較プローブ2チャンネルのER灌流欠損、。 MCA-O =中大脳動脈閉塞。 CCA-O =総頸動脈閉塞。 PU =灌流ユニット。

図3。梗塞体積の計算のための代表的な脳切片組織学的冠状切片（50μm以下、250μmの間隔を有するn = 19;ブレグマ2.5ミリメートル-3.0ミリメートル）が。クレシルバイオレット0.1％、4％パラホルムアルデヒドとステンドで固定されている。梗塞体積は、ImageJの画像処理ソフトを用いて計算脳水腫に起因する大脳半球間非対称性を補正し^、3ミリメートルで表されます。 拡大図を表示するにはここをクリック

図4。ニューロンの損失と半影の分子マーカーの免疫染色代表連続した脳切片をアール示すように、クレシルバイオレット0.1％（A）で染色またはニューロン喪失のマーカー（タンパク質2、MAP2を微小管関連、B）を用いて免疫染色された。と虚血性半影（熱ショック蛋白質70、HSP70、C）。

ディスカッション

私たちは社内で1またはMCAO手順の間にラットの無傷の頭蓋骨への複数のツインファイバー（深い浸透）LDプローブの確実な取り付けのためのシンプルで低コストのシステムを開発しました。それは滑らかな信号検出と脳血流を正常に監視するための前提条件であるので、明らかに些細な問題ではあるが、頭蓋骨にLDプローブの信頼性のある添付ファイルを取得することは、実際にこの実験設定において大きな課題となっている。

このようなバリの穴と骨ねじなどの侵襲的処置は、通常、手術時間を延長し、開頭術に関連した、より実験的な変数を導入し、これは研究者を思いとどまらせるとLD監視を使用してからそれらを控えることがあります。一方、頭蓋表面に直接接着することがより薄く、比較的容易である単繊維（低浸透）プローブの使用は、低品質の信号を提供し、頭蓋骨をドリルや間伐せずに成体ラットで確実に使用することはできません。

我々は、天然ゴムのような単純かつ低コストの材料、プラスチックチューブおよび金属スタイレットを使用していました。カスタムメイドのプローブホルダは数分で生成され、実験条件に適合させることができます。これらのプローブホルダは、虚血性コア上または同じ半球内または2つの半球間で異なる動脈の地域で複数サイトの監視のための古典的な単一サイトの監視のために、一つ以上の深い浸透LDのプローブを収容することができます。多くのプローブホルダーは製造、化学的に滅菌し、将来の使用のために保存することができる。冷たい空気で加速獣医認定の外科糊（cyanoacrilate）は、所望の頭蓋座標によると、ラットの頭蓋骨の無傷の表面にプローブホルダーを取り付けるために使用されます。最後に、プローブのセットアップは、さらに一般的な縫合によって所定の位置に固定されています。

マスタリング後のセットアップこのLDプローブの全体的な時間に、この技術は、約10分である。

私が示したようにおよび末梢MCA領域（LDプローブ2：主に半影領域）内：nこのビデオは、私たちは日常的に中央のMCAの領土（虚血コアLDプローブ1）脳血流を監視します。我々の最近の研究では、LDプローブ2（52％±16％、SD、ベースラインと比較して平均値）における血流変化のばらつきがに比べてLDのプローブ1（31％±6％SDを意味する、と比較して高くなることが示されたベースライン）と脳卒中転帰^4を予測するために使用することができる。

私たちは、社内開発したシステムを使用したいのですが研究者のためのいくつかのトラブルシューティングのアドバイスを提供することがあります。実験の開始時に、早期の剥離を防止するために、プローブホルダーを取り付ける前に、非常によく頭蓋骨面（メルブロミンと冷たい空気で）乾燥するように注意してください。さらに、プラスチックチューブの開放端とLDプローブの光学面との接触を避け、天然ゴムに接着剤を適用することが劣悪な信号やプローブへの潜在的な損傷を防ぐために必ず。動物の頭の周りに縫合糸を結ぶ際には、（これは下顎の骨の上に縫合糸を配置することによって阻止される）気道閉塞を避けるために注意してください。プローブを位置決めし、固定した後ではなく、牽引用プローブケーブルに気をつけて頸部手術のために仰臥位で動物を入れたときに、このステップは、通常2人、一匹の動物を持っている人とプローブケーブルを保持する第2の人を必要とし、静かにそれらを配置する所望の位置に。最後に、ツインファイバーLDプローブの最終的な血液汚染が容易に製造業者によって提供クリーニング指示に従って管理されます。

脳血流モニタリングのための私達の最適化されたシステムでは、この映像に示すように、プローブに簡単に、より迅速で、より信頼性の高い代替手段を提供することができ、現在、この分野で民間企業が販売しているシステムをセットアップ。また、他の研究者によるこのシステムの使用はスタッドを高めることができると信じている脳担保治療薬の新世代の開発につながる実験脳卒中分野における脳血行動態のy、。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			機器
MoorVMS LDF-2チャンネルレーザードップラーモニター	ムーアインスツルメンツ
VP12プローブ	ムーアインスツルメンツ
			試薬/素材
Doccolシリコンコーティングされたフィラメントサイズ4から0まで、コーティング0.39ミリメートルと直径	Doccol株式会社	403956PK10
新生児のための天然ゴム、 例えば共通のおしゃぶり			複数サプライヤー
金属スタイ、脊髄針18ジョージア×90 mm ​​から例えば			複数のサプライヤ
注入25ジョージアx 20 mmのために設定静脈などからプラスチック製のチューブ、			複数のサプライヤ
非吸収性縫合糸、コーティングされた、編んだシルク			複数のサプライヤ
シアノアクリレート系接着剤外科			複数のサプライヤ
イソフルラン（100％v / v）の動物用			複数のサプライヤ