Intraluminar Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ve Sıçan Strok Model Serebral Perfüzyon İzleme için Optimize Sistemi

Özet

Serebral perfüzyon izleme iskemik inme modelleri doğruluğunu geliştirmek için gösterilmiştir. Teknik zorluklar sıklıkla serebrovasküler araştırma için bu önemli aracının kullanımını sınırlamak. Bu videoda, optimize edilmiş bir sistem sıçanlarda intraluminal orta serebral arter oklüzyonu sırasında tek veya çoklu-site hemodinamik izleme elde etmek gösterilmiştir.

Özet

Klinik öncesi inme araştırma translasyonel potansiyeli deneysel modelleme doğruluğuna bağlıdır. Akut iskemik inme hayvan modellerinde Serebral perfüzyon izleme başarılı arteriyel oklüzyon onaylamak ve subaraknoid kanama çıkarılmasına izin verir. Serebral perfüzyon izleme de inme sonucu güçlü bir belirleyici ve olası bir tedavi hedefi olarak ortaya çıkmaktadır intrakranial kollateral dolaşım, incelemek için kullanılabilir. Deneysel serebral iskemi için geçerli kurallar çerçevesinde Lazer Doppler perfüzyon izleme tanınan bir rolü olmasına rağmen, teknik zorluklar bir dizi bu sınırı yaygın kullanımı vardır. Önemli konulardan biri hayvanın kafatasına bir derin penetrasyon Lazer Doppler probu bir güvenli ve uzun süreli bağlanma elde edilir. Bu videoda, biz sıçan intraluminal filament tarafından geçici orta serebral arter oklüzyon sırasında serebral perfüzyon izlenmesi için Optimize sistemi gösterir. Biz i geliştirdin-house gerekirse multi-site izleme izin (derin penetrasyon) ikiz fiber Lazer Doppler problar için özel yapılmış tutucu elde etmek basit bir yöntem. Serebral perfüzyon sürekli ve uzun süreli izleme kolayca sağlam kafatası üzerinde elde edilebilir.

Giriş

Bu önemli bir konu genellikle paradoksal temel araştırma çalışmaları ¹ tarafından ihmal edilmektedir yana inme patofizyolojisi ve tedavisi etkileyen hemodinamik faktörlere Translasyonel araştırma, uygulanması gerekmektedir.

Serebral perfüzyon izleme doğru iskemik inme modelleme ² için, gerekli, ancak kapatacağı araçtır. Kenara subaraknoid kanama ³ arteryel damar tıkanıklığı ve dışlama teyidi, sürekli serebral perfüzyon izleme perfüzyon açığı, intrakranial kollateral damarların fonksiyonel durumu ve yeni tedavi yaklaşımları hemodinamik etkisinin derecesi ve tutarlılığı hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.

Grubumuzun yeni bir çalışma multi-site hemodinamik izleme intrakranial kollateral dolaşımın değerlendirilmesi ve infarkt ve fonksiyonel açığı ⁴ tahmin edebilirsiniz kullanılabilir göstermektedir. Bu deneysel bulgular consi vardırserebral kollateral dolaşımın fonksiyonel performans iskemik inme hastalarında ^{5, 6} klinik sonucunu belirlemede olduğunu gösterdi klinik çalışmalar ile stent. Bu nedenle, serebral teminatlar iskemik inme ⁷ akut faz potansiyel bir tedavi hedefi olarak savunulmuştur.

Laser-Doppler (LD) araçların deneysel iskemik inme ve bunların kullanımı bu tema ⁸ yeni kurallar tarafından önerilen serebral perfüzyon ölçmek için kullanılan en yaygın araçtır. LD tek lif LD probları ⁹ kıyasla daha derin bir penetrasyon sağlayan ikiz elyaf LD probları ile küçük kortikal hacim aletleri ölçü mikrovasküler perfüzyon, lif ayrılık genişliği bağımlı olmak kaydedilen sinyal derinliği. Kan akımı değerleri yerine mutlak serebral kan akımı görece daha belirtmek keyfi perfüzyon üniteleri (PU) olarak ifade edilmiştir. PU Kalibrasyon genellikle istimal yapılırg motilite standartları, üreticinin talimatlarına göre. LD flowmetre aynı oturum içinde sürekli dinamik izleme ve nicel veri üretimi sağlar.

Şu anda LD kullanımını sınırlamak teknik sorunlar arasında, önemli bir konu hayvanın kafatasına bir derin penetrasyon Lazer Doppler probu bir güvenli ve uzun süreli bağlanma elde edilir. Bu uzun süreli izlenmesi için gerekli olan ve çoklu problar bizim laboratuarında performans gibi farklı serebral arteriyel bölgeler için kullanılır eğer.

Problar burr hole veya kranial vidaları kullanarak kafatasına bağlı eğer tek lif (düşük penetrasyon) LD probları basit cerrahi yapıştırıcı ile kafatası ekli ise zayıf sinyal ve güvensiz bağlanma oluşur ise, özellikle, uzamış ameliyat süresi, gereklidir. İkiz lif (derin penetrasyon) LD probları yüksek ve daha tutarlı sinyal verin, ama onlar tek bir fiber problar daha büyük ve az olamazcerrahi yapıştırıcı sadece kullanarak kafatasına tached.

Bu videoda, biz sıçan intraluminal filament tarafından geçici orta serebral arter oklüzyon sırasında serebral perfüzyon izlenmesi için Optimize sistemi gösterir. Biz sağlam kafatası üzerinde serebral perfüzyon uzun süreli izlenmesi için kullanılacak tek veya birden fazla çift-fiber (derin penetrasyon) için etkili, özel yapım, düşük maliyetli sahibi LD probları, elde etmek için basit bir yöntem tarif.

Sıçanlarda geçici MCAO için cerrahi prosedür Uluç ve arkadaşları tarafından ¹⁰ video madde olarak görülebilir ve bu görüntü de gösterilmemiştir.

Protokol

1. Prob Tutucu (Tek Site veya Multi-site) nasil yapilir

1. Gerekli malzemeler, doğal kauçuk, küçük plastik borular ve bir metal stileyi vardır. Prob tutucu hayvanın boyutu, Lazer Doppler probların sayısı ve boyutu ve izlenmesi gerekir serebral vasküler topraklarına özelleştirilebilir.
2. Ihtiyaç duyulan boyut (yaklaşık 10 mm bir sıçan için, 300 g x 10 mm), doğal kauçuk kesin.
3. İstenen stereotaksik koordinatlar göre, sondanın (ler) ve doğal kauçuk bregma bir şekilde işaretleyin; orta serebral arter oklüzyonu, iskemik çekirdek için tipik koordinatlar bregma -1 mm ile 5 mm yanal beklenir midline; periferik iskemik borderzone bölge için, beklenen koordinatlar bregma +2 mm, orta hat için lateral 2 mm olabilir.
4. Çok net bir X bregma yerini işaretleyin, bu kafatası için prob tutucu bağlamak için bir dönüm noktası olduğunu.
5. Küçük bir plastik tüp (boyutu prob boyutuna eşit olması gerekir) içine stile yerleştirin.
6. Sonda yerleştirilmelidir noktada doğal kauçuk içine stileyi yerleştirin; plastik boru da lastik içine sokulduğu kadar lastik içine itmek stileyi.
7. Stile çekin.
8. Birden probları gerekiyorsa, tekrar diğer prob pozisyonlar için 1.5-1.7 adımları.
9. Birden problar için Opsiyonel: probları daha iyi bir istikrar sağlamak amacıyla plastik tüpler etrafında bir bant sarın.
10. İsteğe bağlı: gelecekteki kullanımlar için çeşitli prob yuvaları kimyasal sterilizasyon gerçekleştirin.

2. Preoperatif Hazırlık

1. MCAO inme modeli genellikle sağkalım cerrahi olarak yapılır. Bu durumda, hem bizim video gösterildiği (yaşam süresi 24 saat sonrası ameliyat), cerrah steril alet ve malzemeleri ile aseptik bir teknik kullanır.
2. Izofluran ile anestetize sıçan (% 3 simültanen faz,% 1.5 bakım).
3. Ameliyat masasında yüzüstü sıçan yerleştirin.
4. Yavaşça sıçan tıraş.
5. Bir gazlı bez antiseptik bir solüsyon uygulayın ve cildin dezenfekte edin.
6. % 2 Lidokain uygulayınız 5 subkutan kranialinde mg / kg.

3. Prob yerleştirme ve bozulmamış Kafatası üzerinde Güvenliğini

1. Sağ paramedian cilt kesisi (sağ MCAO için) yapın ve kraniyal fasya (galea aponeurotica) ulaşmak için subkutan doku teşrih.
2. Kranial fasyaya sağ paramedian kesi yapın ve kafatası kemiği ulaşmak için künt diseksiyon; prob tutucu uygulaması için yeterince büyük bir kafatası kemiği alanı hazırlamak.
3. Lütfen dikkat: sondaj veya kemik incelmesi gerek.
4. Kafatası yüzeyi dezenfekte ve kurumaya Merbromin çözümü uygulayın.
5. Kafatası yüzeyinde kuruma hızlandırmak için bir saç kurutma makinesi (soğuk hava için ayarlanmış) kullanın.
6. Bu noktada, kranial sütürler ve bregma açıkça görülebilir.
7. Steril makasla kenarları keserek prob tutucu özelleştirin.
8. Dikkatle plastik tüplerin alt açılış (lütfen kaçınarak, prob tutucu altındaki yüzeye cerrahi yapıştırıcı küçük bir miktar (veteriner onaylı, Siyanoakrilat) Uygula: tutkal önemli miktarda optik prob yüzeyi arasındaki kalırsa kafatası, bu) bir düşük sinyal üretebilir ve çoklu kullanımdan sonra probun zarar verebilir.
9. Dikkatle X işareti ile bregma eşleşen, kafatası yüzeyinde prob tutucu uygulayın. Prob tutucu üzerinde hafif basınç uygulayın.
10. Cerrahi yapıştırıcı kurutma hızlandırmak için bir saç kurutma makinesi (soğuk hava için ayarlanmış) kullanın.
11. Prob tutucu ve hayvanın başının etrafında bir ameliyat ipliği bağlayarak prob tutucu sabitleyin; mandibula üzerinde cerrahi diş konumlandırmak için dikkatli olun, submandibular bölge ve inci kaçınarake boyun.
12. İsteğe bağlı: Bir optik jel (ortak bir ultrason veya elektrokardiyografi jel gibi) ile prob tutucu plastik tüp (ler) doldurun, bu LD sinyalin kalitesini artıracaktır.
13. Prob tutucu içinde sonda (s) yerleştirin ve LD debimetrenin gerçek okuma kontrol edin. Üreticinin talimatlarına göre LD debimetre kullanın.
14. Submandibular bölge ve boyun kaçınarak, mandibula üzerinde cerrahi diş konumlandırmak için dikkatli olun; hayvanın başının etrafında onları bağlıyor prob (lar) sabitleyin.

4. MCAO Serebral Perfüzyon İzleme

1. Dikkatli bir sonda (ler) i ya da prob tutucu üzerinde çekiş kuvvetleri kaçınarak, yatar pozisyonda sıçan yerleştirin.
2. MCAO sırasında serebral perfüzyon izleme başlayın.

5. Prob Temizleme (lar) ve Prob Tutucu

1. Sonda (s), prob tutucu ve hayvanın başı çevresinde dikişler kesin.
2. Yavaşça prob tutucu doğal kauçuk tabanı etrafında kraniyal yumuşak doku ve cildi teşrih künt.
3. Prob tutucu çıkarın.
4. Kafatası yüzeyi bir antiseptik solüsyon uygulayın.
5. Kranial cilt dikin.

6. Post-operatif Bakım

1. Subkutan dehidratasyonu önlemek ve gaz anestezi durdurduktan sonra bir ısıtma pedi kullanarak hayvan sıcak tutmak için salin solüsyonu 2.5 ml uygulayın.
2. Sağkalım cerrahi için: subkutan Ketoprofen 4 mg / kg ile preemptif analjezi sağlamak ve 12 saat ameliyat sonrası aynı doz tekrarlanmalıdır
3. Bizim deneysel koşullar altında, ötenazi CO ₂ inhalasyon ile 24 saat sonrası ameliyat yapıldı.

Sonuçlar

Geçici MCAO (60 dk) eksternal karotid arterin bir silikon kaplı filamanın takarak oluşturuldu. Filament sonra LD izleme altında, MCA kökeni internal karotis arter terminal sonuna kadar itildi. Ortak karotis arter ve pterygopalatin arterin geçici filament cerrahi yerleştirme sırasında tıkanmıştır. Cerrahi işlemin bir şematik temsili Şekil 1A 'de gösterilmiştir.

İki LD problar konumlandırma kraniyal koordinatları yatan arteriyel alana göre seçilmiştir. Kollateral akımı arasındaki borderzone bölgede beklenen ise; jelatin mürekkep perfüzyon ile ön denemeler (Şekil 1B) iskemik çekirdek merkez MCA topraklarında (Probe 1 bregma -1 mm, orta hattan 5 mm) beklendiği olduğunu gösterdi orta ve ön serebral arterlerin kortikal dalları (bregma +2 mm, orta hattan 2 mm; Probe 2).

Serebral hemodinami (Şekil 2) sırasında ve MCAO sonra, yani önce, cerrahi işlemin süresi boyunca çok site Laser Doppler problar kullanılarak incelenmiştir. MCAO sırasında serebral perfüzyon açığı küçüktü ve Probe 1 ile karşılaştırıldığında Prob 2 değişkenliğin yüksek bir derecede göstermiştir, iskemik koşullarda intrakranial kollateral fonksiyonel performanstaki arası bireysel farklılıkları ortaya koymak. Çoklu-site Laser Doppler izleme de proksimal ekstra-kranyal serebral arterlerin (karotis arter, internal karotis arter, pterygopalatin arter) oklüzyon sırasında serebral hemodinamik değişiklikleri incelemek için olanak sağlar.

İnme sonucu kresil violet (Şekil 3), ve Garcia fonksiyonel neuroscore ¹¹ ile boyanarak 19 ardışık bölümleri üzerinde hesaplanan, infarkt hacmi ile reperfüzyon sonrası 24 saat değerlendirildi. Spesifik belirteçler asso için İmmünohistokimyaiskemik beyin hasarı ile ilişkilidir intrakraniyal dolaşım çok yer hemodinamik izleme ile ilgili nöronal kayıp (Protein 2, map2 ilişkili mikrotübül) ve iskemik penumbra (ısı şoku proteini 70, Hsp70) topografik bir dağılım elde etmek üzere yapılmış, (Şekil 4).

Şekil 1. Sıçan intraluminal MCAO sırasında serebral perfüzyon izleme. Geçici MCAO için cerrahi işlem A. şematik gösterimi. Bir silikon kaplı filamanın eksternal karotis arter tanıtıldıktan sonra, MCA kökeni tıkamak için kullanılan ve internal karotis arter yoluyla itildi. Proksimal servikal arterlerin ya bağlandı (eksternal karotis arter) veya prosedürü sırasında (pterygopalatin arter ve karotis arter) geçici tıkalı edildidure. B. temsilcisi beyin jelatin-mürekkep boyandıktan sonra gösterilir. Jelatin-mürekkep çözümü Transcardiac perfüzyon reperfüzyon olmadan iskemi başlangıcından sonra 60 dk yapıldı. Normalde perfüze beyin jelatin-mürekkep ile boyanmış ve iskemik (perfüze olmayan) alanında boyanmadan kalırken (pembe renkli), siyah lekeli damarları ile gri renkli olarak ortaya çıkmıştır. LD iki prob konumlandırılması için kranyal koordinatlar gösterilmiştir. Probe 1 bregma gelen = -1 mm, orta hattan 5 mm; Prob 2 = bregma, orta hattan 2 mm +2 mm.

Şekil 2. Çoklu-site Laser Doppler problar kullanılarak serebral hemodinamik kayıtları. Iskemik koşullarda işlevsel olarak aktif intrakranial kollateral anlaşılacağı tipik hemodinamik deseni gösterilir. Bu hayvanlarda, LD kayıtlarında küçük gösterdiProb 2 kanal er perfüzyon açığı, CCA oklüzyon ve MCA tıkanıklığı sırasında 1 kanal, Probe'a karşılaştırıldı. MCA-O = orta serebral arter oklüzyonu. CCA-O = karotis arter oklüzyonu. PU = perfüzyon birimleri.

Şekil 3,. Infarkt hacminin hesaplanması için Temsilcisi beyin kesitleri histolojik koronal kesitler (50 um; n 250 mikron aralığı = 19; bregma +2.5 mm -3.0 mm). Kresil violet% 0,1 ile% 4 paraformaldehid ve lekeli giderilmiştir. Infarkt hacmi serebral ödem nedeniyle interhemisferik asimetri için düzeltilmiş ImageJ görüntü işleme yazılımı kullanılarak hesaplanmış ve mm ³ olarak ifade edilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın

Şekil 4. Nöron kaybı ve yarı gölge moleküler belirteçlerin immün Temsilcisi ardışık beyin kesitleri gösterilmeyen, kresil violet% 0.1 (A) ile boyanmış veya nöron kaybı belirteçleri (protein 2, map2 ilişkili mikrotübül; B) ile immünhistokimyasal hangi. Ve iskemik penumbra (ısı şok protein-70, Hsp70; C).

Tartışmalar

Biz in-house bir veya MCAO prosedürü sırasında farelerin sağlam kafatasına birden (derin penetrasyon) ikiz fiber LD problar güvenli bir bağlanma için basit ve düşük maliyetli bir sistem geliştirdi. Düzgün bir sinyal algılama ve serebral perfüzyon başarılı bir izleme için ön koşuldur yana görünüşte önemsiz bir sorun olsa, kafatasına LD prob güvenilir bir eki almak, aslında bu deneysel ortamda önemli bir konudur.

Böyle burr hole ve kemik vidaları gibi invazif işlemler, genellikle cerrahi süresini uzatmak ve kraniotomi ile ilgili daha fazla deneysel değişkenlerin tanıtmak ve bu araştırmacıların cesaretini ve LD izleme kullanarak onları kaçınabilir. Öte yandan, tek bir fiber kullanımı (düşük penetrasyon) kafatasının yüzeyine direkt olarak yapıştırılmış olması daha ince ve göreceli olarak kolay olan sondalar, düşük kalitede bir sinyal verir ve kafatası delme veya inceltme olmadan yetişkin fareler ile güvenli bir şekilde kullanılamaz.

Biz doğal kauçuk, plastik borular ve metal bir stile gibi basit ve düşük maliyetli malzemeler kullanılır. Ismarlama prob tutucu birkaç dakika içinde üretilmiş ve deneysel koşullara adapte edilebilir. Bu prob yuvaları iskemik çekirdek veya aynı yarımkürede veya iki hemisfer arasında farklı arteriyel bölgede birden çok site izleme için klasik tek site izleme için, bir veya daha derin penetrasyon LD problar ağırlayacak. Birçok prob yuvaları üretilir, kimyasal sterilize ve gelecekte kullanılmak üzere saklanabilir. Soğuk hava ile hızlandırılmış Veteriner tarafından onaylanmış cerrahi yapıştırıcı (cyanoacrilate), istenen kafatası koordinatlara göre, sıçan kafatasının yüzeyine sağlam prob tutucu bağlamak için kullanılır. Son olarak, prob set-up daha sık dikişlerle yerine sabitlenir.

Set-up bu LD prob genel zaman, mastering bu teknik sonra, yaklaşık 10 dk.

As i gösterilirve periferik MCA topraklarında (LD prob 2: ağırlıklı bir halkalı bölge): n Bu video, rutin merkezi MCA topraklarında (iskemik çekirdek LD probu 1) serebral perfüzyon izlemek. Bizim son çalışmada LD probu 2 (% 52 ±% 16 SD, başlangıca göre ortalama) kan akımı değişiklikleri ve değişkenliği ile karşılaştırıldığında LD probu 1 (% 31 ± 6% SS, kıyasla daha yüksek olduğunu göstermiştir bazal) ve inme sonucu ⁴ tahmin etmek için de kullanılabilir.

Biz bizim in-house geliştirilen sistem kullanmak istiyorum araştırmacılar için bazı sorun giderme önerileri sunabilir. Denemenin başında, erken dekolmanı önlemek için prob tutucu takmadan önce çok iyi kafatası yüzeyi (Merbromin ve soğuk hava ile) kuru dikkatli olun. Ayrıca, plastik tüpün açık ucu ve LD prob optik yüzey ile teması önlemek için, doğal kauçuk üzerinde yapıştırıcı uygulamak için zayıf bir sinyal verir ve sonda ile potansiyel zarar görmesini önlemek için emin olun. Hayvanın başı çevresinde dikiş bağlama işleminde (bu, çene kemiği üzerinden dikiş konumlandırma ile önlenir) solunum yolu obstrüksiyonu önlemek için dikkat edin. Problar konumlandırılması ve güvence sonra, çekişi değil prob kabloları için dikkatli olmak servikal cerrahi için sırtüstü pozisyonda hayvan açarken, bu adım genellikle iki kişi, bir hayvan tutan kişi ve prob kabloları tutan ikinci bir kişi gerektirir ve onları hafifçe konumlandırma istenen konuma. Son olarak, ikiz-fiber LD prob nihai kan kontaminasyonu kolayca üreticisi tarafından sağlanan temizlik talimatları izleyerek yönetilmektedir.

Bu videoyu gösterildiği serebral perfüzyon izleme Bizim optimize sistem, sonda anda bu alanda ticari şirketler tarafından satılan set-up sistemlere daha kolay, daha hızlı ve daha güvenilir bir alternatif sağlayabilir. Ayrıca, diğer araştırmacılar tarafından bu sistemin kullanımı saplama artırabilir inanıyoruzserebral teminat terapötiklerin yeni nesil gelişimini sağlayan deneysel inme alanında serebral hemodinami, y.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Ekipman
MoorVMS-LDF 2-kanal Lazer Doppler Monitörü	Moor Aletleri
VP12 prob	Moor Aletleri
			Reaktif / Malzeme
Doccol silikon kaplı filament büyüklüğü 4-0, kaplama 0.39mm çaplı	Doccol Şirketi	403956PK10
Yeni doğmuş bebekler için Doğal kauçuk, örneğin ortak bir emzik			Çoklutedarikçileri
Metal stile, spinal iğne 18 GA x 90 mm ​​örn.			Birden tedarikçileri
Infüzyon 25 GA x 20 mm için belirlenen venden örneğin Plastik borular,			Birden tedarikçileri
Emilmeyen sütür, kaplamalı, örgülü ipek			Birden tedarikçileri
Siyanoakrilat cerrahi yapıştırıcı			Birden tedarikçileri
Izofluran (% 100 v / v) veteriner kullanımı için			Birden tedarikçileri