Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

요약

뇌 관류 모니터링은 허혈성 뇌졸중 모델의 정확성을 향상시키기 위해 입증되었습니다. 기술적 인 문제는 종종 뇌 혈관 연구에 대해이 필수적 도구의 사용을 제한 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 최적화 된 시스템은 쥐의 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 단일 또는 다중 사이트 hemodynamic 모니터링을 얻기 위해 표시됩니다.

초록

사전 임상 뇌졸중 연구의 병진 잠재력은 실험 모델링의 정확성에 따라 달라집니다. 급성 허혈성 뇌졸중의 동물 모델에서 뇌 관류 모니터링 성공적으로 동맥 폐색을 확인하고 subarachnoid의 출혈을 제외 할 수 있습니다. 뇌 관류 모니터링도 행정 결과의 강력한 결정하는과 가능한 치료 대상으로 대두되고 intracranial 담보 순환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 대뇌 국소 빈혈에 대한 현재의 가이드 라인의 일환으로 레이저 도플러 관류 모니터링의 인식 역할에도 불구하고, 기술적 인 문제의 수는 해당 제한 할의 광범위한 사용을 존재합니다. 주요 문제 중 하나는 동물의 두개골에 깊은 침투 레이저 도플러 프로브의 안전하고 장시간 첨부 파일을 취득합니다. 이 동영상에서는, 우리는 쥐의 intraluminal 필라멘트에 의해 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 뇌성 재관류 모니터링을위한 최적화 된 시스템을 보여줍니다. 우리는 i를 개발N-집 필요한 경우 다중 사이트 모니터링을 허용 (깊은 침투) 트윈 섬유 레이저 도플러 프로브를위한 맞춤 제작 홀더를 얻을하는 간단한 방법입니다. 대뇌 관류의 지속적인 장기간 모니터링은 쉽게 손상 두개골을 통해 획득 할 수있다.

서문

이 중요한 문제가 종종 역설적 기본 연구 ^(1)에 의해 무시되기 때문에 뇌졸중 pathophysiology과 치료에 영향을 미치는 hemodynamic 요인에 병진 연구, 구현해야합니다.

뇌 관류 모니터링은 정확한 허혈성 뇌졸중 모델 ^2, 필수적인하지만, underused 도구입니다. 이외에도 subarachnoid 출혈 ³ 동맥 혈관 폐색과 배제의 확인에서 지속적인 뇌성 재관류 모니터링 재관류 적자, intracranial 부수적 인 혈관의 기능 상태 및 새로운 치료 접근 방식의 hemodynamic 효과의 정도 및 일관성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

우리 그룹의 최근 연구는 다중 사이트 hemodynamic 모니터링 intracranial 담보 순환을 평가하고 경색 크기와 기능 적자 ⁴ 예측할 수 사용할 수 있습니다 나타냅니다. 이러한 실험 결과는 consi 아르뇌성 부수적 인 순환의 기능 성능이 허혈성 뇌졸중 환자 ^{5, 6} 임상 결과의 예측입니다 것으로 나타났다 임상 연구와 스텐트. 이러한 이유로, 뇌성 민간인 피해는 허혈성 뇌졸중 ^(7)의 급성 단계에서 잠재적 인 치료학 대상으로 주창되었습니다.

레이저 도플러 (LD) 장비는 실험 허혈성 뇌졸중 및 사용이 테마 ⁸ 최근 지침에 의해 추천되는의 대뇌 관류를 측정하는 데 사용되는 가장 일반적인 도구입니다. LD 단일 섬유 LD 프로브 ^구에 비해 더 깊은 침투를 허용 트윈 섬유 LD 프로브가있는 작은 대뇌 피질의 볼륨에서 인스트루먼트의 측정 microvascular 재관류, 섬유 분리의 폭에 의존 기록 된 신호의 깊이. 혈액의 흐름 값은 오히려 절대 뇌성 혈액의 흐름보다 상대적으로 나타내는 임의의 재관류 단위 (PU)로 표현됩니다. PU의 보정은 보통 쓰겠다고를 수행하고 있습니다g의 운동성 기준, 제조업체의 지시에 따라. LD flowmetry은 동일한 세션 내에서 지속적인 동적 모니터링 및 정량 데이터를 생성 할 수 있습니다.

현재 LD의 사용을 제한 기술적 인 문제 중 주요 문제는 동물의 두개골에 깊은 침투 레이저 도플러 프로브의 안전하고 장시간 첨부 파일을 취득합니다. 이 장기간 모니터링을 위해 필수적이며, 여러 프로브는 우리 연구실에서 수행하는 등 다른 뇌동맥 지역에 사용하는 경우.

프로브가 버 구멍이나 두개골 나사를 사용하여 두개골에 부착하는 경우 단일 섬유 (낮은 가격순 - 침투) LD 프로브는 간단한 수술 접착제에 의해 두개골에 부착하는 경우 가난한 신호 및 보안 해제 첨부 파일이 발생하는 반면 특히, 장시간 수술 시간은 필요합니다. 트윈 섬유 (깊은 침투) LD 프로브는 높은 더 일관성있는 신호를 제공하지만 단일 광섬유 프로브보다 큰이며에있을 수 없습니다수술 접착제 만 사용하여 두개골에 tached.

이 동영상에서는, 우리는 쥐의 intraluminal 필라멘트에 의해 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 뇌성 재관류 모니터링을위한 최적화 된 시스템을 보여줍니다. 우리는 그대로 두개골 이상 뇌성 재관류의 장기 모니터링에 사용되는 하나 또는 여러 개의 트윈 섬유 (깊은 침투)에 대한 효율적 맞춤 제작, 저렴한 비용 홀더 LD 프로브를 얻기 위해 간단한 방법을 설명합니다.

쥐의 과도 MCAO에 대한 수술 절차는 Uluç와 동료 ^(10)에 의해 비디오 기사에서 볼 수있는이 비디오에 표시되지 않습니다.

프로토콜

1. 프로브 홀더를 (싱글 사이트 또는 멀티 사이트) 확인하는 방법

1. 필요한 재료는 천연 고무, 작은 플라스틱 튜브와 금속 탐침 있습니다. 프로브 홀더는 동물의 크기, 레이저 도플러 프로브의 수와 크기, 모니터링해야하는 대뇌 혈관 영역으로 사용자 정의 할 수 있습니다.
2. 필요한 크기 (약 10mm 300g 쥐에 대한 × 10 ㎜)의 천연 고무를 잘라.
3. 원하는 stereotaxic 좌표에 따르면, 프로브 (들)과 천연 고무의 bregma의 위치를​​ 선택, 중간 대뇌 동맥 폐색를 들어, 허혈성 코어에 일반적으로 좌표는 bregma -1 mm,에 옆 5mm에서 예상됩니다 중간 선은, 주변 허혈성 borderzone 영역에 대해 예상 좌표를 bregma 2mm, 중간 선에 측면 2mm에서 할 수 있습니다.
4. 명확 X와 bregma의 위치를​​ 표시,이 두개골에 프로브 홀더를 부착 랜드 마크입니다.
5. 작은 플라스틱 튜브 (크기는 프로브의 크기가 일치해야합니다)로 탐침을 삽입합니다.
6. 탐사선이 위치되어야 시점에서 천연 고무에 탐침을 삽입, 플라스틱 튜브가 너무 고무에 삽입 될 때까지 고무로 탐침을 누르십시오.
7. 탐침를 철회 할 수 있습니다.
8. 여러 프로브가 필요한 경우, 반복은 다른 프로브 위치에 대한 1.5-1.7 단계를 반복합니다.
9. 여러 프로브에 대한 선택 사항 : 프로브의 더 나은 안정성을 보장하기 위해 플라스틱 튜브 주위에 테이프를 감아.
10. 선택 사항 : 향후 사용에 대한 몇 가지 프로브 소유자의 화학 살균을 수행합니다.

2. Presurgical 준비

1. MCAO 뇌졸중 모델은 일반적으로 생존 수술로 수행됩니다. 이 경우, 당사 비디오에 표시 (생존 시간 24 시간 수술)을 외과 의사는 살균 장비와 공급 무균 기술을 사용합니다.
2. isoflurane과 쥐를 마취 (3 % inductio을N 단계, 1.5 %의 유지 보수).
3. 운영 테이블에 발생하기 쉬운 위치에 쥐를 놓습니다.
4. 부드럽게 쥐의 머리를 면도.
5. 거즈 패드에 살균 솔루션을 적용하고 피부를 소독.
6. 2 % Lidocaine 관리 5 피하 두개 지역의 MG / kg.

3. 프로브 위치와 그대로 두개골을 초과 확보

1. 오른쪽 paramedian 피부 절개를 (오른쪽 MCAO 용)하고 두개골 근막 (galea aponeurotica)를 도달하기 피하 조직을 해부.
2. 두개골 근막에서 우회전 paramedian을 절개하고 두개골 뼈에 도달 할 무딘 절개를 수행하고, 프로브 소유자의 응용 프로그램에 대해 충분히 큰 두개골 뼈 영역을 준비합니다.
3. 참고 없음 : 드릴링이나 숱이 뼈에 필요합니다.
4. 두개골 표면을 소독하고 건조 할 수 Merbromin 솔루션을 적용합니다.
5. 두개골 표면을 건조 가속화 할 수있는 헤어 드라이어를 (찬 공기에 대해 설정)을 사용합니다.
6. 이 시점에서, 두개골 봉합과 bregma 분명히 볼 수 있습니다.
7. 멸균 가위로 가장자리를 절단하여 프로브 홀더를 사용자 정의합니다.
8. 조심스럽게 플라스틱 튜브의 하부 개방 (참고 피 프로브 홀더 아래에있는 표면에 수술 접착제의 작은 수량을 (수의학 승인, 시아 노 아세틸렌) 적용 대상 : 접착제의 상당한 금액은 광학 프로브의 표면 사이에 남아있는 경우 두개골이)는 낮은 신호를 생성 할 수 있으며 다양한 용도 후 프로브가 손상 될 수 있습니다.
9. 신중하게 X 랜드 마크와 bregma 일치, 두개골 표면에 프로브 홀더을 적용합니다. 프로브 홀더 통해 부드러운 압력을 적용합니다.
10. 수술 접착제 건조 가속화 할 수있는 헤어 드라이어를 (찬 공기에 대해 설정)을 사용합니다.
11. 프로브 홀더와 동물의 머리 주위 수술 스레드를 묶는하여 프로브 홀더를 고정하고, mandibula 위에 외과 실을 배치 할 조심해, 턱밑 지역과 일을 피전자 목.
12. 선택 사항 : 광학 젤 (일반 초음파 또는 electrocardiography 젤을 예를 들어)와 프로브 홀더의 플라스틱 튜브 (들)을 작성,이 LD 신호의 품질을 높일 수 있습니다.
13. 프로브 홀더에 프로브 (들)을 놓고 LD 유량계의 실제 읽기를 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 LD 유량계를 사용하십시오.
14. 턱밑 지역과 목을 피 mandibula 위에 외과 실을 배치 할주의, 동물의 머리 주위를 매는 탐사선이 (들) 고정합니다.

4. MCAO 동안 뇌 관류 모니터링

1. 조심스럽게 프로브 (들) 또는 프로브 홀더에 tractional 힘을 피 부정사 위치에 쥐를 놓습니다.
2. MCAO 동안 대뇌 관류 모니터링을 시작합니다.

5. 프로브의 제거 (들)과 프로브 홀더

1. 프로브 (들), 프로브 홀더와 동물의 머리 주위 봉합을 잘라 요.
2. 부드럽게 프로브 소유자의 천연 고무 기지 주변에 두개의 부드러운 조직과 피부를 해부 퉁명.
3. 프로브 홀더를 제거합니다.
4. 두개골 표면에 살균 솔루션을 적용합니다.
5. 두개골 피부를 봉합 해.

6. 수술 케어

1. 피하 탈수를 방지하고 가스 마취을 중지 한 후 가열 패드를 사용하여 동물 따뜻하게 유지하는 생리 식염수 2.5 ML를 관리 할 수​​ 있습니다.
2. 생존 수술의 경우 : 피하 케토 프로 펜 4 밀리그램 / kg으로 선제 진통제를 제공하고 12 시간 후 operatively에서 동일한 용량을 반복
3. 우리의 실험 조건에서 안락사는 CO ₂ 흡입으로 24 시간 수술에서 수행되었다.

결과

과도 MCAO (60 분)은 외부 경동맥의 실리콘 코팅 필라멘트를 삽입하여 유도되었다. 필라멘트 그런 다음 LD 모니터링 아래에있는 MCA의 출처에 속목 동맥의 터미널 끝으로 밀어 넣었습니다. 온목 동맥과 pterygopalatin 동맥 transiently 필라멘트의 수술 삽입시 occluded되었습니다. 수술 절차의 개략도는 그림 1A에 표시됩니다.

두 LD 프로브을 위치시키기위한 두개의 좌표는 기본 동맥 지역에 따라 선정되었습니다. 담보 흐름이 사이의 borderzone 지역에서 예상하는 동안, 젤라틴 잉크 살포와 예비 실험 (그림 1B)는 허혈성 핵심은 중앙 MCA 지역 (프로브 1 bregma -1 mm, 중간 선에서 5 ㎜)에 예상됩니다 것을 보여 주었다 중, 앞 뇌동맥의 피질 가지 (bregma 2mm, 중심에서 2mm, 프로브 2).

뇌 혈류 역학은 (그림 2) 과정과 MCAO 후, 즉 전에 수술의 전체 기간 동안 다중 사이트 레이저 도플러 프로브를 사용하여 연구되었다. MCAO 동안 뇌성 재관류 적자가 작습니다 및 프로브 1에 비해 프로브 2 다양성의 높은 수준을 보여, 허혈성 조건 intracranial 민간인 피해의 기능 성능에 간 개별 차이를 제안. 다중 사이트 레이저 도플러 모니터링은 근위 추가 - 두개골 대뇌 동맥 (온목 동맥, 속목 동맥, pterygopalatin 동맥)의 폐색 동안 대뇌 hemodynamic 변경 사항을 연구 할 수 있습니다.

뇌졸중 결과는 Cresyl 보라색 (그림 3), 그리고 가르시아 기능 neuroscore ¹¹ 물들 19 연속 섹션에 계산 경색 볼륨에 의해 reperfusion 후 24 시간을 평가했다. 특정 마커 asso을위한 Immunohistochemistry허혈성 뇌 손상과 ciated는 intracranial 순환 다중 사이트 hemodynamic 모니터링과 관련하여 neuronal 손실 (단백질 2, MAP2에 연결된 미세 소관) 및 허혈성 penumbra (열 충격 단백질 70, Hsp70)의 지형 분포를 얻기 위해, 수행되었다 (그림 4).

1 그림. 쥐의 intraluminal MCAO 동안 뇌 관류 모니터링. 과도 MCAO에 대한 수술 절차의 A. 도식 표현입니다. 실리콘 코팅 필라멘트는 외부 경동맥에 소개 된 후, MCA의 출처를 윗니와 아랫니가 맞 물리다하는 데 사용하고 속목 동맥을 통해 밀고되었습니다. 근위 자궁 경부 동맥이 중 출혈도 잡았 (외부 경동맥)이나 proce 동안 (pterygopalatin 동맥과 온목 동맥) transiently occluded되었습니다dure. B. 대표의 뇌는 젤라틴 잉크 얼룩 후에 표시됩니다. 젤라틴 잉크 솔루션의 Transcardiac 재관류은 reperfusion없이 국소 빈혈의 발병 후 60 분을 수행했다. 일반적으로 perfused 뇌는 젤라틴 잉크로 물들어과 허혈성 (-perfused되지 않음) 지역은 흠없는 유지하면서 (핑크 색), 검은 색 스테인드 선박과 회색 색으로 등장했다. 두 LD 프로브을 위치시키기위한 두개골의 좌표가 표시됩니다. 프로브 1 bregma에서 = -1 mm, 중간 선에서 5mm, 프로브 2 = bregma, 중심에서 2mm에서 2mm.

그림 2. 다중 사이트 레이저 도플러 프로브를 사용하여 뇌 hemodynamic 녹음. 허혈성 조건에 따라 기능적으로 활성 intracranial 민간인 피해를 제안 전형적인 hemodynamic 패턴이 표시됩니다. 이 동물에서 LD의 tracings는 작은을 보여 주었다프로브 2 채널의 음 재관류 적자는 CCA 가림 및 MCA 폐색 모두 중 1 채널을 내기 위해 비교했다. MCA-O = 중간 대뇌 동맥 폐색. CCA-O = 온목 동맥의 폐색. PU = 재관류 단위입니다.

그림 3. 경색 볼륨의 계산을위한 대표자 뇌 섹션 조직 학적 코로나 섹션 (50 μm, N 250 μm 간격으로 = 19; bregma 2.5 mm에 -3.0 mm)가. Cresyl 보라색 0.1 %와 4 % paraformaldehyde과 스테인드에 고정되어 있습니다. 경색의 볼륨은 대뇌 부종 또는 팽창으로 인한 간 반구형의 asymmetries에 대한 수정 ImageJ 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 계산하고, mm ^3에 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오

4 그림. neuronal 손실 및 penumbra의 분자 마커의 Immunostaining 대표 연속 뇌 섹션가 표시됩니다, Cresyl 바이올렛 0.1 % (A) 물들 또는 neuronal 손실 마커 (단백질 2, MAP2에 연결된 미세 소관, B)와 immunostained 된. 및 허혈성 penumbra (열 충격 단백질 70, Hsp70, C).

토론

우리는 사내에서 하나 또는 MCAO 절차를 수행하는 동안 쥐의 손상 두개골에 여러 (깊이 침투) 트윈 섬유 LD 프로브의 보안 첨부 파일 간단하고 저렴한 시스템을 개발했습니다. 그 부드러운 신호 감지 및 뇌성 재관류의 성공적인 모니터링을위한 전제 조건이기 때문에 확실히 사소한 문제에도 불구하고, 두개골에 LD 프로브의 신뢰할 수있는 첨부 파일을 취득하면, 실제로이 실험 설정에서 주요 문제입니다.

이러한 버 구멍 뼈 나사 등의 침습적 절차는 일반적으로 수술 시간을 연장하고 craniotomy에 관한 더 많은 실험 변수를 소개하고,이 연구를 권장하고 LD 모니터링 사용을 삼가 할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 단일 섬유의 사용 (낮은 침투) 두개골의 표면에 직접 접착 할 얇고 비교적 쉽게 프로브는, 품질이 낮은 신호를 제공하고 두개골을 뚫는 또는 썼음없이 성인 쥐와 함께 안정적으로 사용할 수 없습니다.

우리는 천연 고무, 플라스틱 튜브와 금속 탐침과 같은 간단하고 저렴한 재료를 사용했습니다. 주문 제작 프로브 홀더는 몇 분에서 생산하고 실험 조건에 적응 할 수 있습니다. 이 프로브 홀더는 허혈성 코어 또는 동일한 반구 또는 두 반구에서 다른 동맥 지역에서 여러 사이트 모니터링을위한 클래식 한 사이트 모니터링을 위해 하나 이상의 깊은 침투 LD 프로브를 이용하실 수 있습니다. 많은 프로브 홀더는 생산, 화학적으로 소독하고, 나중에 사용하기 위해 저장 될 수 있습니다. 찬 공기에 의해 가속 수의 승인 수술 접착제 (cyanoacrilate)는, 원하는 두개의 좌표에 따르면, 쥐 두개골의 손상 표면에 프로브 홀더를 부착하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 프로브 설정은 또한 일반적인 봉합으로 자리에 고정된다.

설정이 LD 프로브의 전체 시간은 마스터이 기술 후, 10 분에 있습니다.

로 내가 표시그리고 주변 MCA 지역 (LD 프로브 2 : 주로 반영 영역)에서 : n이 비디오는, 우리는 정기적으로 중앙 MCA 지역 (허혈성 핵심 LD 프로브 1) 뇌성 세례를 모니터링 할 수 있습니다. 최근 연구에서 우리는 LD 프로브 2 (52 % ± 16% SD, 기준에 비해 의미)의 혈액 흐름 변화의 다양성이에 비해 LD 프로브 1 (31 % ± 6퍼센트 SD를 말에 비해 높은 것으로 나타났다 기준)과는 뇌졸중 결과 ^(4)를 예측하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 우리의 자체 개발 시스템을 사용하고자하는 연구자에 대한 몇 가지 문제 해결 조언을 제공 할 수 있습니다. 실험의 시작 부분에서 조기 분리를 방지하기 위해 프로브 홀더를 부착하기 전에 잘 두개골 표면을 (Merbromin과 차가운 공기) 건조주의해야합니다. 또한, 플라스틱 튜브의 열린 끝과 LD 프로브의 광학 표면과 접촉을 피하고, 천연 고무에 접착제를 적용 할 가난한 신호 프로브에 잠재적 인 손상을 방지하기 위해 반드시. 동물의 머리 주위로 봉합을 매는 경우, (이는 mandibular 뼈를 통해 봉합을 배치하여 방지)기도 폐쇄를 방지하기 위해주의해야합니다. 프로브를 위치와 고정 후,하지 견인 프로브 케이블에주의 자궁 수술 부정사 위치에 동물을 돌려 경우,이 단계는 일반적으로 두 사람, 하나 동물을 가지고 사람과 프로브 케이블을 들고 두 사람을 필요로하고 부드럽게 그들을 위치 원하는 위치합니다. 마지막으로, 트윈 섬유 LD 프로브의 최종 혈액 오염이 쉽게 제조업체에서 제공하는 청소 지침에 따라 관리됩니다.

본 동영상에 나타난 뇌성 재관류 모니터링을위한 최적화 된 시스템, 프로브 현재이 분야에서 상업 회사에 의해 판매됩니다 설정 시스템보다 쉽게​​,보다 신속하고보다 신뢰할 수있는 대안을 제공 할 수 있습니다. 또한, 우리는 다른 연구자에 의해이 시스템의 사용 피어싱을 향상 할 수 있다고 생각뇌성 부수적 인 치료학의 새로운 세대의 개발로 이어지는 실험 행정 분야에서 뇌성 혈류 역학의 Y.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			장비
MoorVMS-LDF 2 채널 레이저 도플러 모니터	무어 악기
VP12 프로브	무어 악기
			시약 / 재료
Doccol 실리콘 코팅 필라멘트 크기 4-0, 코팅 0.39mm와 지름	Doccol 공사	403956PK10
신생아를 위해 천연 고무는, 예를 들어 일반적인 젖꼭지			복수공급 업체
금속 탐침, 척추 바늘 18 GA X 90mm의 예			여러 공급 업체
주입 25 GA X 20mm로 설정 정맥에서 예를 들면 플라스틱 튜브,			여러 공급 업체
Nonabsorbable 봉합, 코팅, 편조 실크			여러 공급 업체
시아 노 아세틸렌 수술 접착제			여러 공급 업체
Isoflurane (100 % V / V) 수의학 사용			여러 공급 업체