מערכת אופטימלית לניטור זלוף מוחות במודל שבץ העכברוש של חסימת עורק מוח האמצעית intraluminal

Summary

ניטור זלוף מוחות הודגם לשיפור דיוק במודלים של שבץ איסכמי. קשיים טכניים לעתים קרובות להגביל את השימוש בכלי חיוני זה למחקר כלי דם במוח. בסרטון הזה, מערכת אופטימיזציה מוצגת להשיג ניטור המודינאמית בודד או מרובה אתרים בחסימת עורק מוח האמצעית intraluminal בחולדות.

Abstract

פוטנציאל translational של מחקר שבץ טרום קליני תלוי במידת הדיוק של מודלים ניסיוניים. ניטור פרפוזיה מוחית במודלים של בעלי חיים של שבץ איסכמי חריף מאפשר לאשר חסימת עורקים מוצלחת ואינו כולל דימום תת עכבישים. ניטור זלוף מוחות יכול לשמש גם כדי ללמוד במחזור ביטחונות תוך גולגולתי, אשר מתעורר כגורם רב עצמה של תוצאת שבץ ויעד טיפולי אפשרי. למרות תפקיד מוכר של ניטור זלוף דופלר ליזר כחלק מההנחיות הנוכחיות לאיסכמיה המוחית ניסיונית, מספר הקשיים טכניים קיים מגבלה שהשימוש הנרחב שלה. אחד הנושאים העיקריים הוא להשיג התקשרות בטוחה ומתמשכת בחדירה עמוקה ליזר דופלר חללית לגולגולת של בעלי החיים. בסרטון הזה, אנחנו מראים מערכת אופטימיזציה שלנו לניטור פרפוזיה מוחי במהלך חסימה חולפת עורק מוח האמצעית, בנימת intraluminal בחולדה. פתחנו ליn בית שיטה פשוטה להשיג מחזיק בהתאמה אישית לבדיקות תאומת סיבים (לחדירה עמוקה) ליזר דופלר, המאפשרים ניטור אתרים מרובים במידת צורך. ניטור רציף ומתמשך של זלוף מוחות בקלות יכול להיות מושגת על הגולגולת השלמה.

Introduction

מחקר translational בגורמים המשפיעים על hemodynamic פתופיזיולוגיה וטיפול שבץ צריך להיות מיושם, שכן נושא חשוב זה מוזנח לעתים קרובות באופן פרדוקסלי על ידי מחקרים בסיסיים ^1.

ניטור זלוף מוחות הוא כלי חיוני, אך מספק, לדוגמנות שבץ איסכמי מדויקת ^2. מלבד האישור של חסימת עורקי כלי והדרה של דימום תת עכבישים ^3, ניטור זלוף מוחות מתמשך עשוי לספק מידע מועיל לגבי המידה והעקביות של גירעון זלוף, המצב התפקודי של כלי טחונות תוך גולגולתי והשפעה המודינאמית של גישות טיפוליות חדשות.

מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו מצביע על כך שהניטור המודינאמית אתרים מרובים ניתן להשתמש כדי להעריך את זרימת דם תוך גולגולתי וביטחונות יכול לחזות גודל אוטם וגירעון תפקודי ^4. ממצאי ניסויים אלה הם consiתומכן במחקרים קליניים אשר הראו כי ביצועים התפקודיים של זרימת ביטחונות מוחות הם חיזוי של תוצאה קלינית בחולי שבץ מוחי איסכמי ^{5, 6.} מסיבה זו, בטחונות מוחיות כבר דגל כמטרה רפויה פוטנציאל בשלב החריף של ⁷ שבץ איסכמי.

ליזר דופלר מכשירים (LD) הם הכלי הנפוץ ביותר המשמש למדידת הפרפוזיה מוחית בשבץ איסכמי ניסוי והשימוש בם מומלץ על ידי ההנחיות האחרונות בנושא זה ^8. LD זלוף מכשירי מדידת כלי דם בנפח קליפת מוח קטן, את העומק של האות המוקלט להיות תלוי ברוחב של הפרדת סיבים, עם בדיקות LD סיבי תאומים ומאפשרים חדירה עמוקה יותר בהשוואה לבדיקות LD סיב בודדות ^9. ערכי זרימת דם מבוטאים כיחידות זלוף שרירותיות (PU) המצביעים יחסי ולא מוחלטת זרימת דם במוח. כיול של יחידת השיטור מתבצע לרוב usinסטנדרטי תנועתיות גרם, על פי הוראות היצרן. LD flowmetry מאפשר ניטור רציף דינמי ודור של נתונים כמותיים באותה הפגישה.

בין הבעיות הטכניות שכרגע מגבילים את השימוש של LD, סוגיה מרכזית היא להשיג התקשרות בטוחה וממושכת לחדירה עמוקה ליזר דופלר חללית לגולגולת של בעלי החיים. זה חיוני לניטור מתמשך ואם בדיקות מרובות משמשים לשטחי עורקים מוחיים שונים, כפי שאנו מבצעים במעבדה שלנו.

בפרט, זמן ממושך כירורגית נדרש אם בדיקות מצורפות לגולגולת באמצעות חורי Burr או ברגי גולגולת, בעוד שאות חלשה וקובץ מצורף לא מאובטח מתרחשות אם בדיקות LD אחת סיבים (-חדירה נמוכה) מחוברות לגולגולת על ידי דבק רפואי פשוט. (-חדירה עמוקה) בדיקות סיבי תאומי LD תהווינה איתות גבוהה יותר ועקבית יותר, אבל הם גדולים יותר מחלליות סיב בודדות ולא יכולות להיות בtached לגולגולת באמצעות דבק רפואי בלבד.

בסרטון הזה, אנחנו מראים מערכת אופטימיזציה שלנו לניטור פרפוזיה מוחי במהלך חסימה חולפת עורק מוח האמצעית, בנימת intraluminal בחולדה. אנו מתארים שיטה פשוטה להשיג בעל יעיל, Custom Made, עלות נמוכה ל( חדירה עמוקה-) תאום סיב בודד או מרובה בדיקות LD, שישמש לניטור ממושך של זלוף מוחות מעל הגולגולת השלמה.

ההליך כירורגי לMCAO החולף בחולדה ניתן היה לראות בוידאו מאמרו של עמיתים לעבודה וUluç ¹⁰ ואינו מוצג בסרטון זה.

Protocol

1. איך להכין מחזיק Probe (אתר יחיד או באתר רב)

1. החומרים הדרושים הם גומי טבעי, צינורות פלסטיק קטנים וstylet מתכת. בעל הבדיקה ניתן להתאים לגודלו של בעל החיים, המספר והגודל של בדיקות ליזר דופלר, ושטח כלי הדם המוחי שצריך להיות במעקב.
2. חותך את הגומי הטבעי של הגודל דרוש (כ 10 מ"מ x 10 מ"מ לעכברוש 300 גרם).
3. סמן את עמדותיה של החללית (הים) וגבחת בגומי הטבעי, על פי קואורדינטות stereotaxic הרצויים; לחסימת עורק מוח אמצעית, הקואורדינטות האופייניות לליבת איסכמי צפויות בגבחת -1 מ"מ, 5 מ"מ לרוחב כדי קו אמצע; לטריטורית borderzone איסכמי היקפית, הקואורדינטות הצפויות יכול להיות ב2 מ"מ גבחת, 2 מ"מ לרוחב לקו האמצע.
4. סמן את המיקום של גבחת עם X בצורה מאוד ברור, זה הציון דרך לחיבור למחזיק החללית לגולגולת.
5. הכנס stylet לתוך צינור פלסטיק קטן (בגודל שלה צריך להתאים לגודל של החללית).
6. הכנס stylet לגומי הטבעי בנקודה בה את החללית צריכה להיות ממוקמת; לדחוף stylet לתוך הגומי עד צינור הפלסטיק הוכנס לתוך הגומי מדי.
7. לסגת stylet.
8. אם בדיקות מרובות יש צורך, חזור על שלבים 1.5-1.7 לעמדות בדיקה נוספות.
9. אופציונלי לבדיקות מרובות: לעטוף את קלטת סביב צינורות הפלסטיק כדי להבטיח ייצוב טוב יותר של החלליות.
10. אופציונלי: מבצע עיקור כימי של כמה בעלי בדיקה לשימושים עתידיים.

2. הכנת Presurgical

1. מודל שבץ MCAO מתבצע לרוב כניתוח הישרדות. במקרה זה, כפי שמוצג בסרטון שלנו (זמן הישרדות 24 שעות לאחר ניתוח), המנתח משתמש בטכניקת aseptic עם מכשירים וציוד מעוקרים.
2. הרדם עכברוש עם isoflurane (inductio 3%n שלב, אחזקה של 1.5%).
3. הנח את העכבר בתנוחת שכיבה על שולחן הניתוחים.
4. בעדינות לגלח את הראש של החולדה.
5. החל תמיסת חיטוי לתחבושת ולחטא את העור.
6. לנהל ידוקאין 2% 5 מ"ג / ק"ג תת עורי באזור הגולגולת.

3. מיקום חללי ואבטחה, על הגולגולת השלמה

1. הפוך חתך בעור paramedian ימינה (לMCAO ימין) ולנתח את הרקמה התת עורית להגיע fascia הגולגולת (Galea aponeurotica).
2. עושה חתך paramedian ממש בfascia הגולגולת ולבצע נתיחה בוטה להגיע לעצם הגולגולת; להכין אזור עצם גולגולת שהוא גדול מספיק ליישומו של בעל המכשיר.
3. שים לב: אין צורך בקידוח או עצם דליל.
4. החל פתרון Merbromin כדי לחטא ולייבש את משטח הגולגולת.
5. השתמש במייבש שיער (שנקבע לאוויר קר) כדי להאיץ את ייבוש שטח הגולגולת.
6. בשלב זה, את התפרים של הגולגולת וגבחת ניכרים לעין.
7. התאמה אישית של בעל בדיקה על ידי גזירת הקצוות עם מספריים סטריליים.
8. החל כמות קטנה של דבק רפואי (cyanoacrylate, וטרינרית שאושרה) למשטח מתחת בעל החללית, הימנעות הפתיחה הנחותה מצינורות הפלסטיק (שים לב בזהירות: אם כמות משמעותית של דבק נותרת בין המשטח האופטי של החללית ואת גולגולת, זה יכול לייצר אות נמוכה ועלול לגרום ניזק לחללית לאחר שימושים מרובים).
9. החל בעל הבדיקה למשטח הגולגולת, התאמת גבחת עם ציון X בזהירות. הפעל לחץ עדין על בעל הבדיקה.
10. השתמש במייבש שיער (שנקבע לאוויר קר) כדי להאיץ את ייבוש הדבק הרפואי.
11. אבטח את בעל בדיקה על ידי קשירת חוט כירורגית סביב בעל החללית וראשו של בעל החיים; להיות זהיר, כדי למקם את החוט כירורגית מעל mandibula, הימנעות אזור הלסת התחתון והצוואר דואר.
12. אופציונלי: למלא את צינורית הפלסטיק (ים) של מחזיק החללית עם ג'ל אופטי (למשל אולטרסאונד משותף או ג'ל electrocardiography); זה ישפר את האיכות של אות LD.
13. הנח את החללית (הים) בבעל הבדיקה ולאמת את הקריאה בפועל של flowmeter LD. השתמש flowmeter LD פי הוראות היצרן.
14. אבטח את החללית (ים) קושרת אותן מסביב לראשו של בעל החיים; להיות זהירה, כדי למקם את החוט כירורגית מעל mandibula, הימנעות אזור הלסת התחתון והצוואר.

4. ניטור זלוף מוחות במהלך MCAO

1. הנח את העכבר במצב שכיבה, הימנעות כוחות tractional זהירות על החללית (הים) או בעל בדיקה.
2. התחל ניטור פרפוזיה מוחי במהלך MCAO.

5. הסרת הבדיקה (הים) ומחזיק Probe

1. חותך את התפרים סביב החללית (ים), בעל החללית וראשו של בעל החיים.
2. עדינות להקהות לנתח רקמות רכות של גולגולת ועור מסביב לבסיס הגומי הטבעי של בעל המכשיר.
3. הסר את בעל המכשיר.
4. החל תמיסת חיטוי למשטח הגולגולת.
5. לתפור את עור הגולגולת.

6. טיפול לאחר הניתוח

1. לנהל 2.5 מ"ל של תמיסת מלח מתחת לעור על מנת למנוע התייבשות ולשמור חמי בעלי החיים באמצעות כרית חימום לאחר הפסקת הרדמת גזים.
2. לניתוח הישרדות: מספק שיכוך כאבים מקדים עם Ketoprofen 4 מ"ג / ק"ג תת העור ולחזור על אותה המנה ב 12 שעות שלאחר operatively
3. בתנאי הניסוי שלנו, המתת החסד בוצעה ב 24 שעות שלאחר ניתוח על ידי ₂ משאיפת CO.

תוצאות

MCAO חלוף (60 דקות) היה מושרה על ידי החדרת חוט סיליקון מצופה בעורק התרדמה החיצוני. הנימה הייתה אז דחפה סוף הטרמינל של עורק התרדמה הפנימי עד למקורו של MCA, תחת ניטור LD. עורק תרדמה משותף ועורק pterygopalatin היו occluded transiently במהלך ההחדרה כירורגית של חוט הלהט. ייצוג סכמטי של ההליך כירורגי מוצג באיור 1 א.

קואורדינטות הגולגולת למיצוב שתי בדיקות LD נבחרו בהתאם לשטח העורקים הבסיסי. ניסויים ראשוניים עם זלוף דיו ג'לטין (האיור 1B) הראו כי ליבת איסכמי צפוי בשטח המרכזי MCA (גבחת -1 המ"מ, 5 מ"מ מקו האמצע; 1 Probe), בעוד זרימת הביטחונות צפויים בשטח borderzone בין ענפי קליפת מוח של עורקי מוח אמצעיים וקדמיים (גבחת 2 מ"מ, 2 מ"מ מקו האמצע; Probe 2).

פרמטרים המודינמיים מוחיים נחקרו באמצעות בדיקות מרובים אתרי ליזר דופלר במהלך כל תקופת ההליך כירורגי, כלומר לפני, במהלך ואחרי MCAO (איור 2). גירעון פרפוזיה המוחית במהלך MCAO היה קטן והראה רמה גבוהה יותר של שונות בProbe 2 לעומת 1 Probe, מה שמרמז הבדלים בין בודדים בביצועים התפקודיים של ביטחונות תוך גולגולתי בתנאי איסכמי. ניטור האתר רב ליזר דופלר גם מאפשר ללמוד את השינויים המוחיים hemodynamic במהלך החסימה של עורקי מוח חוץ גולגולתיים הפרוקסימלי (עורק תרדמה משותף, עורק תרדמה הפנימי, עורק pterygopalatin).

תוצאת השבץ הוערכה 24 שעות לאחר reperfusion לפי נפח אוטם, המחושבת על 19 סעיפים רצופים מוכתמים סגול Cresyl (איור 3), והתפקודי גרסיה ¹¹ neuroscore. אימונוהיסטוכימיה לסמנים ספציפיים associated עם פגיעה מוחית איסכמי בוצע, כדי להשיג פיזור טופוגרפי של אובדן הנוירונים (microtubule הקשור חלבון 2, MAP2) ופנומברה איסכמי (הלם חום חלבון-70, Hsp70) ביחס לניטור המודינאמית מרובים אתרים של זרימה תוך גולגולתי (איור 4).

איור 1. ניטור זלוף מוחות במהלך MCAO intraluminal בחולדה. ייצוג סכמטי של א ההליך כירורגי לMCAO החולף. חוט סיליקון מצופה שמש לסגור מוצא של MCA, לאחר שהציג בעורק הצוואר החיצוני ודחף דרך עורק התרדמה הפנימי. עורקי צוואר רחם הפרוקסימלי גבעול אחד (עורק צוואר חיצוני) או transiently occluded (עורק pterygopalatin ועורק תרדמה משותף) במהלך proceדורה. ב מוח נציג מוצג לאחר צביעת ג'לטין דיו. זלוף Transcardiac של פתרון ג'לטין הדיו בוצעו 60 דקות לאחר תחילת איסכמיה, ללא reperfusion. המוח בדרך כלל perfused היה מוכתם בכתמי דיו ג'לטין והופיע כצבע אפור עם כולים מוכתמים שחורים, ואילו באזור איסכמי (לא-perfused) נותר בתוליים (בצבע ורוד). קואורדינטות גולגולת למיצוב שתי בדיקות LD מוצגות. 1 Probe = -1 מ"מ מגבחת, 5 מ"מ מקו האמצע; Probe 2 = 2 מ"מ מגבחת, 2 מ"מ מקו האמצע.

איור 2. הקלטות hemodynamic מוחיות באמצעות בדיקות מרובות אתרי ליזר דופלר. דפוס המודינאמית טיפוסי שמציע ביטחונות תוך גולגולת תפקודית פעילים בתנאי איסכמי מוצג. בחיה זו, העתקי LD הראו קטןגירעון זלוף אה בערוץ 2 Probe, לעומת לחקור ערוץ 1, במהלך הוא מרכז לאמנות עכשווית וחסימת MCA חסימה. MCA-O = חסימת עורק מוח האמצעי. CCA-O = חסימת עורק תרדמה משותפת. יחידות זלוף = PU.

איור 3. חלקי מוח יציגים לחישוב נפח אוטם חתכים ההיסטולוגיים עטרה (50 מיקרומטר, n = 19 עם מרווח מיקרומטר 250; גבחת 2.5 מ"מ ל -3.0 מ"מ). הם קבועים בparaformaldehyde 4% ומוכתמים בסגולים Cresyl 0.1%. נפח אוטם מחושב באמצעות תוכנת ImageJ עיבוד תמונה, תקנה לסימטריות בין hemispheric עקב בצקת מוחית, ומתבטא במ"מ ^3. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה

איור 4. Immunostaining של סמנים מולקולריים של אובדן ופנומברה העצבי חלקי מוח רצוף ייצוג הראה, שהיו מוכתמים בסגול Cresyl 0.1% () או immunostained עם סמנים של איבוד עצבי (microtubule הקשור חלבון 2, MAP2; B). ופנומברה איסכמי (חום הלם החלבון-70, Hsp70; C).

Discussion

אנחנו פתחנו בתוך בית מערכת פשוטה וזולה להתקשרות בטוחה של אחד או בדיקות תאומת סיבים-(חדירה עמוקה) מרובות LD לגולגולת השלמה של חולדות במהלך הליך MCAO. אם כי ככל הנראה בעיה טריוויאלית, קבלת קובץ מצורף אמין של בדיקת LD לגולגולת היא למעשה נושא מרכזי במערך ניסוי זה, שכן הוא התנאי ההכרחי לגילוי אותות חלקים וניטור מוצלח של זלוף מוחות.

פעולות פולשניות, כגון חורי Burr וברגים בעצמות, בדרך כלל להאריך את זמן הניתוח ולהציג את משתנים ניסיוניים יותר הקשורים לפתיחת גולגולת, וזה עלול למנוע מחוקרים ולהימנע מהם באמצעות ניטור LD. מצד השני, השימוש בסיב בודד (חדירה נמוכה) בדיקות, שהם דקים יותר ויחסית קלים יותר להיות מודבקים ישירות על פני הגולגולת, נותן אות באיכות נמוכה ולא ניתן להשתמש באופן אמין עם חולדות בוגרות ללא קידוח או דילול הגולגולת.

אנחנו השתמשנו בחומרים פשוטים וזולים, כגון גומי טבעי, צינורות פלסטיק ומתכת stylet. בעל חללית אישית יכול להיות מיוצר בכמה דקות ומותאמת לתנאי הניסוי. מחזיקי בדיקה אלה יכולים להכיל אחת או יותר בדיקות LD-חדירה עמוקה, לניטור אתר אחד קלסי על ליבת איסכמי או לניטור מרובה אתרים בשטחי עורקים שונים באותה האונה או על פני שתי ההמיספרות. מחזיקי בדיקה רבים יכולים להיות מיוצר, עיקור כימי, ומאוחסנים לשימוש בעתיד. דבק וטרינרית המאושרת כירורגית (cyanoacrilate), שהואץ על ידי אוויר קר, משמש כדי לחבר את המחזיק לבדיקת המשטח השלם של גולגולת החולדה, על פי קואורדינטות גולגולת הרצויה. לבסוף, הגדרת החללית מאובטחת גם במקום על ידי תפרים משותפים.

הזמן הכולל של LD בדיקה זו הגדרה, לאחר מאסטרינג בטכניקה זו, הוא כ 10 דקות.

כפי שהראה ליn בסרטון זה, אנחנו מפקחים באופן שגרתי בפרפוזיה המוחית המרכזי MCA השטח (LD 1 חללית: ליבת איסכמי) ובMCA השטח ההיקפי (LD חללית 2: בעיקר אזור פנומברה). במחקר האחרון שלנו הראו שהשונות של שינויים בזרימת דם בבדיקת LD 2 (כלומר 52% ± 16% SD, בהשוואה לתחילת המחקר) הן גבוהות יותר בהשוואה לבדיקת LD 1 (כלומר 31% ± 6% SD, לעומת בסיסי) וניתן להשתמש בו כדי לחזות ⁴ תוצאת משבץ מוחיים.

אנו עשויים לספק כמה עצות לפתרון בעיות, לחוקרים שהיו רוצים להשתמש במערכת שפותחה בבית שלנו. בתחילת הניסוי, הקפד לייבש את משטח הגולגולת (עם Merbromin ואוויר קר) היטב לפני שחבר בעל החללית כדי למנוע שפיכת ניתוק. יתר על כן, הקפד להחיל את הדבק על הגומי הטבעי, הימנעות ממגע עם הקצה הפתוח של צינור הפלסטיק והמשטח האופטי של LD הבדיקה, כדי למנוע אות עניה וניזק אפשרי לבדיקה. כאשר קשירת התפר סביב ראשו של בעל החיים, להיות זהיר על מנת להימנע מחסימה בדרכי נשימה (זו נמנעת על ידי מיצוב התפר מעל לעצם הלסת). לאחר המיצוב והבטחת הבדיקות, היזהר שלא לכבלי בדיקת מתיחה בעת הפעלת בעלי החיים במצב שכיבה לניתוח צוואר רחם; שלב זה בדרך כלל דורש שני אנשים, אדם אחד מחזיק את בעלי החיים ואדם שני מחזיק את כבלי הבדיקה ועדינות מיצובם למיקום הרצוי. לבסוף, זיהום דם סופי של LD חללית תאומת הסיבים הוא הצליח בקלות בהתאם להוראות הניקוי שסופקו על ידי היצרן.

המערכת שלנו המותאמת לניטור פרפוזיה מוחי, כפי שמוצגת בסרטון הזה, יכול לספק אלטרנטיבה קלה יותר, מהירה יותר ואמינה יותר לבדיקת הגדרת מערכות הנמכרות כיום על ידי חברות מסחריות בתחום זה. יתר על כן, אנו מאמינים כי השימוש במערכת זו על ידי חוקרים אחרים יכול לשפר את ההרבעהy של פרמטרים המודינמיים מוחיים בתחום השבץ הניסיוני, שהובילו לפיתוח דור חדש של תרופות טחונות מוחיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			ציוד
MoorVMS-2-LDF ערוץ הליזר דופלר Monitor	מור מכשירים
VP12 חללית	מור מכשירים
			מגיב / חומרים
גודל Doccol סיליקון מצופה נימה 4-0, קוטר עם הציפוי 0.39mm	Doccol תאגיד	403956PK10
גומי טבעי, מוצצים משותפים דוגמה לתינוקות			מרובהספקים
המתכת stylet, למשל מ 90 מ"מ שדרת מחט 18 GA x			ספקים מרובים
צינורות פלסטיק, למשל מוריד להגדיר עבור 20 מ"מ העירוי 25 GA x			ספקים מרובים
תפר, משי Nonabsorbable מצופה קלוע			ספקים מרובים
דבק רפואי cyanoacrylate			ספקים מרובים
Isoflurane (100% v / v) לשימוש וטרינרים			ספקים מרובים