JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Abstract

CD4 + الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) هي جهري المناعي قوية وتؤدي وظيفة هامة في التوازن المناعي البشري. وقد أدى استنزاف Tregs إلى زيادات ملموسة في استجابة خلايا T مستضد محددة في إعدادات لقاح لسرطان ومسببات الأمراض المعدية. ومع ذلك، ودورها في HIV-1 المناعية المرضية لا تزال مثيرة للجدل، لأنها إما أن تكون لقمع تنشيط جهاز المناعة HIV-1-الضارة المرتبطة بها، وبالتالي إبطاء HIV-1 تطور المرض أو بدلا من قمع الحصانة HIV-1-محددة، وبالتالي تعزيز فيروس تنتشر. فهم وظيفة Treg تحوير في سياق HIV-1 يمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات جديدة محتملة لعلاج مناعي أو لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة مفتوحة على دورهم المهم في سياق فيروس نقص المناعة البشرية 1 العدوى، والتي تحتاج إلى أن تدرس بعناية.

وقد ثبت يمثلون ما يقرب من 5٪ من CD4 + الخلايا التائية البشرية في الدم المحيطي، ودراسة السكان Treg أن يكون صعبا، ESpecially وفي HIV-1 الأفراد المصابين حيث CD4 HIV-1-T الخلية المرتبطة بها ومع يحدث أن استنفاد Treg. توصيف الخلايا التائية التنظيمية في الأشخاص الذين يعانون المتقدمة HIV-1 مرض أو عينات الأنسجة، والتي يمكن الحصول عليها إلا عينات بيولوجية صغيرة جدا، وبالتالي صعبة للغاية. نقترح حلا تقنيا للتغلب على هذه القيود باستخدام العزل والتوسع في Tregs من الأفراد HIV-1-الإيجابية.

نحن هنا وصف طريقة سهلة وقوية لتوسيع بنجاح Tregs معزولة من الأفراد HIV-1-المصابة في المختبر. تدفق فرزها CD3 + CD4 + CD25 + وحفز CD127 منخفض Tregs مع anti-CD3/anti-CD28 حبات مغلفة والمثقف في حضور IL-2. وأعرب الموسع Tregs مستويات عالية من FOXP3، CTLA4 وهيليوس مقارنة مع الخلايا T التقليدية، وعرضت أن تكون قمعية للغاية. وتسهيل الوصول إلى أعداد كبيرة من Tregs تسمح للباحثين لمعالجة طأسئلة MPORTANT بشأن دورها في HIV-1 إمراض مناعي. ونحن نعتقد الإجابة على هذه الأسئلة يمكن أن توفر نظرة متعمقة مفيدة لتطوير AN-1 فيروس نقص المناعة البشرية قاح فعال.

Introduction

مع أكثر من 34 مليون شخص يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز في جميع أنحاء العالم ويقدر بنحو 2.5 مليون شخص أصيبوا حديثا في عام 2011، والحاجة إلى لقاح مضاد لفيروس نقص المناعة البشرية فعالة لكبح جماح وباء فيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم لا تزال بالغة. ومع ذلك، على الرغم من ثلاثة عقود من الجهود البحثية المكثفة، أسفرت HIV-1 لقاح التجارب فعالية حتى الآن في حماية متواضعة فقط 1-3 ويرتبط الحصانة الواقية تظل غير مفهومة. توضيح طبيعة الاستجابة المناعية اللازمة لحماية أمر ضروري لتصميم استراتيجية لHIV-1 قاح فعال واستراتيجيات immunotherapeutic أخرى تستهدف HIV-1 العدوى.

CD4 + الخلايا التائية الطبيعية التنظيمية (Tregs) هي الحاسمة في الحفاظ على توازن الخلايا المناعية من خلال التحكم في تنشيط جهاز المناعة المفرطة، مما يحد من تلف الأنسجة مناعية. ومع ذلك، فإنها يمكن أيضا قمع الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض ومنع إزالتها. السرطان وهيباوقد أثبتت الدراسات titis قاح B أن خفض النشاط من Tregs يمكن أن تعزز استجابة لقاح والمستضد محددة حصانة ضد الفيروسات 4-7. ومع ذلك، في سياق HIV-1 العدوى، ويبقى التأثير الدقيق لخلايا T التنظيمية غير مفهومة تماما. عرضت Tregs لتقليل تكاثر الفيروس في الخلايا المنشطة T 8 و ربما تؤثر تنشيط جهاز المناعة 9. وقد تبين أيضا أنها لقمع الاستجابات المناعية HIV-1-محددة، والتي يمكن أن تكون لها نتائج سلبية على تطور المرض 10،11. وهكذا، قبل أن يتمكن لتعديل النشاط Treg لتعزيز فعالية لقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1، فمن المهم للحصول على مزيد من التبصر في وظيفتها في هذا السياق المرض.

CD4 + الخلايا التائية البشرية التنظيمية هي مجموعة من السكان الخلية نادرة نسبيا، وهو ما يمثل حوالي 5٪ من خلايا CD4 + T في الدم المحيطي، وأعدادهم المطلقة مزيد من الانخفاض مع فيروس نقص المناعة البشرية CD4 + T المرتبطة نضوب الخلية 12 </ سوب>. المقايسات الحالية لتقييم وظيفة Treg، مثل T الخلية المقايسات الانتشار مع Treg الثقافة المشتركة، واستخدام أرقام خلية كبيرة نسبيا 12. ولذلك، واصفا وظيفة ونوعية الخلايا التائية التنظيمية في الأشخاص الذين يعانون المتقدمة HIV-1 مرض تم تحدي، على الرغم من أهميتها بالنسبة لإمراض فيروس نقص المناعة البشرية.

عزلة فيفو السابقين وتوسيع Tregs من HIV-1 المرضى يمكن أن تمثل حلا للتغلب على بعض هذه القيود. نحن هنا وصف بروتوكول سهلة وقوية لتوسيع Tregs الفنية المستمدة من HIV-1 الأفراد المصابين في المختبر، ونحن شرح كيفية زيادة النمط الظاهري لهم واختبار وظيفتها القمعية باستخدام التدفق المقايسات cytometric. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول تسهيل الوصول إلى Tregs وللمساعدة في فهم دورهم في HIV-1 تطور المرض.

Protocol

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood

  1. Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube.
  2. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature.
  3. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical tube for 20 min at 1,200 x g with a slow start and no brakes.
  4. Transfer the CD4+ T cell enriched PBMC layer in a new 50 ml conical tube, wash the cells by adding PBS/2% FBS and spin them down for 10 min at 1,200 x g. Then count the cells, wash again and resuspend the cells at about 20 x 106/200 μl.
  5. Add the following antibodies (concentration):
    anti-CD3-Phycoerythrin-Cyanine 7 (PE-Cy7) (1/100)
    anti-CD4-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (1/40)
    anti-CD25-Allophycocyanin (APC) (1/40)
    anti-CD127-Phycoerythrin (PE) (1/20)
    Incubate 30 min in the dark at 4 °C
  6. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells at 20 x 106/ml in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
  7. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the CD3+CD4+CD25+CD127low Treg in X-VIVO 15 media (see gating strategy in Figure 1). Conventional T cells (CD3+CD4+CD25-CD127+) can be isolated and expanded as negative controls.

2. Cell Culture

  1. After isolation, wash the Treg with X-VIVO 15 media.
  2. Resuspend the cells at 250 x 103/ml in X-VIVO 15 media complemented with 10% Human Serum and Penicillin-Streptomycin (50 U/ml).
  3. Wash Human T-Activator CD3/CD28 beads according to manufacturer's protocol. Add beads to isolated Tregs at a ratio of 1:1 bead per cell.
  4. After two days of culture, double the media volume and add IL-2 (300 U/ml).
  5. Culture the Tregs for 2 weeks. Change media (X-VIVO 15/Human serum/P/S/IL-2) at days 5, 7, 9, 12. Add beads at a 1:1 ratio at day 9. When changing media, keep cells at 250 x 103/ml.

3. Phenotyping

At the end of the expansion culture, expanded CD3+CD4+CD25+CD127low Treg can be phenotyped by flow cytometry and compared to expanded CD3+CD4+CD25-CD127+ conventional T cells as a control.

  1. Harvest expanded Tregs/Tconvs and wash them in PBS. Label dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
  2. Add the following antibodies (concentration):
    anti-CD3-PECy7 (1/100)
    anti-CD4-Qdot-655 (1/200)
    anti-CD25-PECy5 (1/100)
    Incubate 30 min in the dark at 4 °C
  3. Wash the cells and perform the intracellular staining using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set according to manufacturer's protocol and the following antibodies:
    anti-FOXP3-PE (1/50)
    anti-HELIOS-FITC (1/40)
    anti-CTLA4-APC (1/20)
    Acquire the data on a flow cytometer.

4. Suppression Assay

At the end of the expansion culture, the suppressive function i.e. the capacity of the expanded Treg isolated from HIV-1 positive individuals to suppress the proliferation of activated T cells can be assessed in vitro.

  1. Thaw autologous cryopreserved ex vivo PBMCs. Leave them for about 3 hr in a 37 °C incubator in RPMI 1640 medium containing penicillin/streptomycin, L-glutamine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (=R+ media), and 10% FBS (=R10 media).
  2. Label the dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to the manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
  3. Incubate the cells with anti-CD3-PECy7 for 30 min in the dark at 4 °C. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
  4. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the viable CD3+ T cells in R10 media.
  5. Label the T cells with a cell tracing reagent such as CellTrace Violet or Vybrant CFDA SE Cell Tracer at 5 μM diluted in PBS for 7 min at 37 °C according to the manufacturer's protocol. Resuspend cells in R+ media supplemented with 10% human serum (=hR10 media) at 1 x 106/ml.
  6. Harvest the expanded Tregs, resuspend the cells at 0.5 x 106/ml in hR10 and prepare dilutions at 0.25 x 106/ml and 0.125 x 106/ml.
  7. Prepare anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28 microbeads according to the manufacturer's protocol, resuspend the microbeads at 0.75 x 106/ml and prepare dilutions at 0.625, 0.562, 0.5 x 106/ml in hR10 media.
  8. In a 96 wells round bottom plate, transfer cells and beads according to the following plan:
T cells:Treg ratio1:01:1/21:1/41:1/8
T cells (50 μl)1 x 106/ml1 x 106/ml1 x 106/ml1 x 106/ml
Tregs (50 μl)no0.5 x 106/ml0.25 x 106/ml0.125 x 106/ml
Beads (100 μl)0.5 x 106/ml0.75 x 106/ml0.625 x 106/ml0.562 x 106/ml
hR10 (50 μl)yesnonono
i.e.    
T cells50 x 10350 x 10350 x 10350 x 103
Tregs025 x 10312.5 x 1036.25 x 103
Beads50 x 10375 x 10362.5 x 10356.25 x 103
  1. After 4 days of culture, wash the cells and incubate them for 30 min at 4 °C with the following antibodies:
    anti-CD3-PECy7 (1/100)
    anti-CD4-APC (1/100)
    anti-CD8-AF700 (1/100)

Acquire the data on a flow cytometer. Use the FlowJo proliferation platform to calculate the percentage of divided cells.

النتائج

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations 13 and have been shown to correlate with CD4+CD25+FOXP3+ Tregs 9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti...

Discussion

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment CocktailStemcells technologies15062
PBSSigmaD8537
FBSSigmaF4135
HistopaqueSigmaH8889
Anti-CD3-PECy7BD Pharmingen557851
Anti-CD4-FITCeBioscience11-0049-42
Anti-CD25-APCeBioscience17-0259-42
Anti-CD127-PEBD Pharmingen557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon meshBD Falcon352235
X-VIVO 15Lonza04-418Q
Penicillin/StreptomycinMediatech30-001-Cl
Human SerumGemini Bio-Products100-512
Human T-activator CD3/CD28Life Technologies111.31D
IL-2NIH Aids Research Reference Reagent Program136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain KitLife technologiesL34955
Anti-CD4-qdot-655Life TechnologiesQ10007
Anti-CD25-PECy5eBiosciences15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SeteBiosciences00-5523-00
Anti-FOXP3-PEeBiosciences12-4776-42
Anti-HELIOS-FITCBiolegend137204
Anti-CTLA4-APCBD Pharmingen555855
CellTrace Violet Cell Proliferation KitLife TechnologiesC34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitLife TechnologiesV12883
HEPESMediatech25-060-Cl
Treg Suppression inspectorMiltenyi Biotec130-092-909
Anti-CD4-APCBD Pharmingen340443
Anti-CD8-AF700BD Pharmingen557945
RPMI 1640SigmaR0883
GlutamineMediatech25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD)Becton, Dickinson and Company (BD)364606
FACSAria IIu Cell SorterBD Biosciences-
LSR II Flow CytometerBD Biosciences-
FlowJoTree Starv887

References

  1. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  2. Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
  3. Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
  4. Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
  5. Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
  6. Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
  7. Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
  8. Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
  9. Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
  10. Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
  11. Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
  12. Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
  13. Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
  14. De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
  15. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  16. Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
  17. Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
  18. Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
  19. Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
  20. Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
  21. Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
  22. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
  23. Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
  24. Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
  25. Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
  26. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  27. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
  28. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
  29. Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
  30. Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Keywords HIV 1Regulatory T CellsTregsCD4 T CellsImmune ModulationImmunopathogenesisExpansionIn VitroFlow CytometryFOXP3CTLA4HELIOSSuppression

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved