Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

Resumo

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Resumo

CD4 + células T reguladoras (Tregs) são moduladores imunes potentes e têm uma função importante na homeostase imune humano. Esgotamento das Tregs levou a aumentos mensuráveis ​​nas respostas de células T antígeno-específicas em ambientes de vacina para o câncer e agentes infecciosos. Contudo, o seu papel no VIH-1 imuno-patogénese permanece controverso, visto que pode servir tanto para suprimir a activação imunitária ao HIV-1 e, portanto, associada deletério retardar a progressão da doença VIH-1, ou, alternativamente, suprimir a imunidade específica do HIV-1 e, assim, promover a vírus se espalhar. Compreender e função moduladora Treg no contexto do HIV-1 pode conduzir a novas estratégias potenciais para a imunoterapia ou vacinas contra o HIV. Contudo, questões importantes permanecem abertas sobre a sua função no contexto da infecção pelo HIV-1, que tem de ser cuidadosamente estudada.

Representando aproximadamente 5% das células T no sangue periférico CD4 + humanas, estudar a população Treg provou ser difícil, EScipalmente no VIH-1, em que os indivíduos infectados com HIV-1 de células T CD4 associada e com que a depleção de Treg ocorre. A caracterização de células T reguladoras, em indivíduos com doença avançada da doença do HIV-1 ou amostras de tecido, para o qual apenas pequenas amostras biológicas podem ser obtidos, é, portanto, extremamente desafiador. Propomos uma solução técnica para ultrapassar estas limitações, com isolamento e expansão de Tregs de indivíduos infectados pelo HIV-1 positivas.

Aqui, nós descrevemos um método fácil e robusto para desenvolver com sucesso Tregs isolado a partir de indivíduos infectados pelo HIV-1-infected in vitro. Fluxo-ordenadas CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^acessível Tregs foram estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 grânulos revestidos e cultivadas na presença de IL-2. O expandida Tregs expressa níveis elevados de FOXP3, CTLA4 e Helios em comparação com as células T convencionais e mostraram ser altamente supressiva. Acesso mais fácil a um grande número de Tregs permitirá aos investigadores para lidar com important perguntas sobre o seu papel no HIV-1 imunopatogênese. Acreditamos responder a estas perguntas podem fornecer informações úteis para o desenvolvimento de uma vacina contra o HIV-1 eficaz.

Introdução

Com mais de 34 milhões de pessoas que vivem com HIV / AIDS em todo o mundo e um número estimado de 2,5 milhões de pessoas infectadas em 2011, a necessidade de uma vacina anti-HIV eficaz para conter a epidemia de HIV em todo o mundo continua a ser fundamental. No entanto, apesar de três décadas de esforços de pesquisa intensa, a HIV-1 vacina ensaios de eficácia até à data resultaram em apenas uma proteção modesta ^1-3 e os correlatos de imunidade protetora continuam a ser mal compreendido. Elucidar a natureza da resposta imunitária necessária para a protecção é essencial para a criação de uma estratégica eficaz contra o HIV-1, vacina e outras estratégias imunoterapêuticas objectivo infecção HIV-1.

Naturais CD4 + células T reguladoras (Tregs) são essenciais para a manutenção da homeostase imune celular, controlando a activação imunitária excessiva, limitando, assim, danos no tecido imune-mediada. No entanto, eles também podem suprimir as respostas imunes contra os agentes patogénicos e evitar a sua recarga. Câncer e Hepaestudos de vacinas Callicebus B têm demonstrado que a diminuição da actividade de Tregs pode melhorar a resposta à vacina e antigénio específico da imunidade contra vírus ^4-7. No entanto, no contexto da infecção pelo HIV-1, o impacto exato de células T reguladoras permanece incompletamente compreendida. Tregs foram mostrados para diminuir a replicação do vírus em células T ativadas ⁸ e possivelmente impactar ativação imune ^9. Eles também foram mostrados para suprimir respostas imunes-1 HIV-específicas, que poderão ter resultados negativos para a progressão da doença ^10,11. Assim, antes de ser capaz de modular a actividade Treg para aumentar a eficácia de uma vacina contra o HIV-1, que é ainda mais importante para ganhar conhecimento sobre a sua função no contexto da doença.

As células T reguladoras CD4 + humanas são uma população de células relativamente raras, o que representa cerca de 5% de células T CD4 + no sangue periférico, e os seus números absolutos decréscimo adicional de CD4 com o HIV-associados + depleção de células T ^{12 <}/ Sup>. Ensaios atuais para avaliar a função Treg, tais como ensaios de proliferação de células T com Treg co-cultura, use o número de células relativamente grandes ^12. Portanto, a função e a especificidade das células T reguladoras caracterizar em indivíduos com doença avançada da doença do HIV-1 tem sido um desafio, apesar da sua importância para a patogénese do VIH.

O isolamento e a expansão ex vivo de Tregs de pacientes de HIV-1 pode representar uma solução para ultrapassar algumas destas limitações. Aqui nós descrevemos um protocolo fácil e robusta para expandir Tregs funcional derivado de HIV-1 indivíduos infectados in vitro, nós ainda explicar como fenótipo-los e testar sua função de supressão utilizando ensaios de citometria de fluxo. Acreditamos que este protocolo vai facilitar o acesso a Tregs e ajudar a compreender o seu papel no HIV-1 a progressão da doença.

Protocolo

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood

1. Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube.
2. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature.
3. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical tube for 20 min at 1,200 x g with a slow start and no brakes.
4. Transfer the CD4⁺ T cell enriched PBMC layer in a new 50 ml conical tube, wash the cells by adding PBS/2% FBS and spin them down for 10 min at 1,200 x g. Then count the cells, wash again and resuspend the cells at about 20 x 10⁶/200 μl.
5. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-Phycoerythrin-Cyanine 7 (PE-Cy7) (1/100)
   anti-CD4-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (1/40)
   anti-CD25-Allophycocyanin (APC) (1/40)
   anti-CD127-Phycoerythrin (PE) (1/20)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
6. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells at 20 x 10⁶/ml in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
7. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg in X-VIVO 15 media (see gating strategy in Figure 1). Conventional T cells (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺) can be isolated and expanded as negative controls.

2. Cell Culture

1. After isolation, wash the Treg with X-VIVO 15 media.
2. Resuspend the cells at 250 x 10³/ml in X-VIVO 15 media complemented with 10% Human Serum and Penicillin-Streptomycin (50 U/ml).
3. Wash Human T-Activator CD3/CD28 beads according to manufacturer's protocol. Add beads to isolated Tregs at a ratio of 1:1 bead per cell.
4. After two days of culture, double the media volume and add IL-2 (300 U/ml).
5. Culture the Tregs for 2 weeks. Change media (X-VIVO 15/Human serum/P/S/IL-2) at days 5, 7, 9, 12. Add beads at a 1:1 ratio at day 9. When changing media, keep cells at 250 x 10³/ml.

3. Phenotyping

At the end of the expansion culture, expanded CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg can be phenotyped by flow cytometry and compared to expanded CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺ conventional T cells as a control.

1. Harvest expanded Tregs/Tconvs and wash them in PBS. Label dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
2. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-Qdot-655 (1/200)
   anti-CD25-PECy5 (1/100)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
3. Wash the cells and perform the intracellular staining using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set according to manufacturer's protocol and the following antibodies:
   anti-FOXP3-PE (1/50)
   anti-HELIOS-FITC (1/40)
   anti-CTLA4-APC (1/20)
   Acquire the data on a flow cytometer.

4. Suppression Assay

At the end of the expansion culture, the suppressive function i.e. the capacity of the expanded Treg isolated from HIV-1 positive individuals to suppress the proliferation of activated T cells can be assessed in vitro.

1. Thaw autologous cryopreserved ex vivo PBMCs. Leave them for about 3 hr in a 37 °C incubator in RPMI 1640 medium containing penicillin/streptomycin, L-glutamine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (=R+ media), and 10% FBS (=R10 media).
2. Label the dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to the manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
3. Incubate the cells with anti-CD3-PECy7 for 30 min in the dark at 4 °C. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
4. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the viable CD3+ T cells in R10 media.
5. Label the T cells with a cell tracing reagent such as CellTrace Violet or Vybrant CFDA SE Cell Tracer at 5 μM diluted in PBS for 7 min at 37 °C according to the manufacturer's protocol. Resuspend cells in R+ media supplemented with 10% human serum (=hR10 media) at 1 x 10⁶/ml.
6. Harvest the expanded Tregs, resuspend the cells at 0.5 x 10⁶/ml in hR10 and prepare dilutions at 0.25 x 10⁶/ml and 0.125 x 10⁶/ml.
7. Prepare anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28 microbeads according to the manufacturer's protocol, resuspend the microbeads at 0.75 x 10⁶/ml and prepare dilutions at 0.625, 0.562, 0.5 x 10⁶/ml in hR10 media.
8. In a 96 wells round bottom plate, transfer cells and beads according to the following plan:

T cells:Treg ratio	1:0	1:1/2	1:1/4	1:1/8
T cells (50 μl)	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml
Tregs (50 μl)	no	0.5 x 106/ml	0.25 x 106/ml	0.125 x 106/ml
Beads (100 μl)	0.5 x 106/ml	0.75 x 106/ml	0.625 x 106/ml	0.562 x 106/ml
hR10 (50 μl)	yes	no	no	no
i.e.
T cells	50 x 103	50 x 103	50 x 103	50 x 103
Tregs	0	25 x 103	12.5 x 103	6.25 x 103
Beads	50 x 103	75 x 103	62.5 x 103	56.25 x 103

9. After 4 days of culture, wash the cells and incubate them for 30 min at 4 °C with the following antibodies:
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-APC (1/100)
   anti-CD8-AF700 (1/100)

Acquire the data on a flow cytometer. Use the FlowJo proliferation platform to calculate the percentage of divided cells.

Resultados

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations ¹³ and have been shown to correlate with CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Tregs ^9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti...

Discussão

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) ¹⁵, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	Stemcells technologies	15062
PBS	Sigma	D8537
FBS	Sigma	F4135
Histopaque	Sigma	H8889
Anti-CD3-PECy7	BD Pharmingen	557851
Anti-CD4-FITC	eBioscience	11-0049-42
Anti-CD25-APC	eBioscience	17-0259-42
Anti-CD127-PE	BD Pharmingen	557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh	BD Falcon	352235
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30-001-Cl
Human Serum	Gemini Bio-Products	100-512
Human T-activator CD3/CD28	Life Technologies	111.31D
IL-2	NIH Aids Research Reference Reagent Program	136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Life technologies	L34955
Anti-CD4-qdot-655	Life Technologies	Q10007
Anti-CD25-PECy5	eBiosciences	15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	eBiosciences	00-5523-00
Anti-FOXP3-PE	eBiosciences	12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC	Biolegend	137204
Anti-CTLA4-APC	BD Pharmingen	555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Life Technologies	V12883
HEPES	Mediatech	25-060-Cl
Treg Suppression inspector	Miltenyi Biotec	130-092-909
Anti-CD4-APC	BD Pharmingen	340443
Anti-CD8-AF700	BD Pharmingen	557945
RPMI 1640	Sigma	R0883
Glutamine	Mediatech	25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD)	Becton, Dickinson and Company (BD)	364606
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences	-
LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences	-
FlowJo	Tree Star	v887