כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

Summary

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Abstract

CD4 + תאי T רגולטוריים (Tregs) הם מאפננים חיסוניים חזקים ולשרת את התפקיד חשוב בומאוסטזיס חיסון האנושי. דלדול של Tregs הוביל לעליות מדידים בתגובות תא T אנטיגן ספציפיות בהגדרות חיסון לסרטן ופתוגנים זיהומיות. עם זאת, תפקידם בנגיף HIV-1 חיסוני הפתוגנזה נותר שנוי במחלוקת, כפי שהם יכולים גם לשמש כדי לדכא את ההפעלה חיסונית HIV-1-משויכת מזיקה ובכך להאט HIV-1 התקדמות מחלה או לחלופין לדכא את חסינות HIV-1-ספציפית ובכך לקדם את הווירוס להתפשט. הבנה ותפקוד Treg ויסות בהקשר של HIV-1 עשויה להוביל לאסטרטגיות חדשות פוטנציאליות לטיפול חיסוני או חיסונים נגד איידס. עם זאת, שאלות פתוחות חשובות להישאר בתפקידם בהקשר של זיהום HIV-1, אשר צריך להיחקר בזהירות.

המייצג כ -5% מסוג CD4 + T תאי אדם בדם ההיקפי, לומד אוכלוסיית Treg הוכיח להיות קשה, especially בHIV-1 אנשים נגועים בו T מסוג CD4 תאים HIV-1 קשור ועם זה דלדול Treg מתרחש. האפיון של תאי T רגולטוריים באנשים עם HIV מתקדם 1-מחלה או דגימות רקמה, שעבורו ניתן להשיג דגימות ביולוגיות קטנות מאוד בלבד, ולכן היא מאוד מאתגר. אנו מציעים פתרון טכני כדי להתגבר על מגבלות אלה באמצעות בידוד והרחבת Tregs מאנשים HIV-1-חיוביים.

כאן אנו מתארים שיטה קלה וחזקה כדי להרחיב Tregs המבודד בהצלחה מאנשים HIV-1 נגוע-במבחנה. זרימה מסודרים CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^הנמוך Tregs היה מגורה עם anti-CD3/anti-CD28 חרוזים מצופים ותרבית בנוכחות של IL-2. המורחב Tregs הביע רמות גבוהות של FOXP3, CTLA4 והליוס בהשוואה לתאי T קונבנציונליים והוצג להיות מדכא מאוד. גישה קלה יותר למספר גדול של Tregs תאפשר לחוקרים לכתובת שאנישאלות הנוגעות לתפקידם mportant בimmunopathogenesis HIV-1. אנו מאמינים לענות על שאלות אלה עשויים לספק תובנות מועילות לפיתוח של חיסון יעיל HIV-1.

Introduction

עם יותר מ 34 מיליון אנשים חיים עם HIV / איידס ברחבי העולם ושל 2.5 מיליון בני אדם נדבקו לאחרונה בשנת 2011, את הצורך בחיסון ל-HIV יעיל לבלום את מגיפת האיידס ברחבי העולם נותרת בעל חשיבות עליונה. עם זאת, למרות שלושה עשורים של מאמצי מחקר אינטנסיביים, HIV-1 בניסויים יעילות החיסון עד כה הביאו רק ^1-3 הגנה וצנועות וקושרת של חסינות תישאר הבינה היטב. הבהרת טיבה של התגובה החיסונית זקוקה להגנה היא חיונית לעיצוב האסטרטגי של חיסון ל-HIV-1 יעיל ואסטרטגיות immunotherapeutic אחרות מיקוד הידבקות ב-HIV-1.

CD4 הטבעי + תאי T רגולטוריים (Tregs) הם קריטי לשמירה על הומאוסטזיס תא חיסון על ידי שליטה בהפעלת מערכת החיסונית מוגזמת, וכך להגביל את נזק לרקמות חיסונית בתיווך. עם זאת, הם יכולים גם לדכא את התגובה חיסונית נגד פתוגנים ולמנוע הפינוי שלהם. הסרטן וHepaמחקרי חיסון B titis הוכיחו כי הפחתת הפעילות של Tregs יכולה לשפר את תגובת חיסון ואנטיגן ספציפית לחסינות מפני וירוסים ^4-7. עם זאת, בהקשר של זיהום HIV-1, את ההשפעה של תאי T רגולטוריים המדויקת נשארה הבינה באופן חלקי. Tregs הראו ירידה בשכפול נגיף מופעל תאי T ⁸ ואולי להשפיע על הפעלת מערכת החיסונית ^9. הם הוצגו גם כדי לדכא את התגובה חיסונית של HIV-1-ספציפית, שיש בם תוצאות שליליות להתקדמות מחלה ^10,11. לכן, לפני שהוא מסוגל לווסת את פעילות Treg כדי לשפר את היעילות של חיסון HIV-1, זה חשוב כדי לקבל תובנה נוספת לתוך תפקידם בהקשר מחלה זו.

סוג CD4 + אדם תאי T רגולטוריים הם אוכלוסיית תאים נדירה יחסית, המהווה כ 5% מסוג CD4 + T תאים בדם ההיקפי, ומספרים נוספים עם ירידת CD4-HIV הקשורים + T דלדול תא ¹² המוחלטים ^</ Sup>. מבחני הנוכחיים להערכת תפקוד Treg, כגון מבחני התפשטות תאי T עם Treg התרבות משותפת, השתמשו במספרי תא גדולים יחסית ^12. לכן, אפיון פונקציה וספציפיות של תאי T רגולטוריים באנשים עם HIV-1 מתקדם מחלה כבר מאתגרת, למרות חשיבותם לפתוגנזה HIV.

הבידוד לשעבר vivo והרחבת Tregs מחולי HIV-1 יכולים לייצג פתרון כדי להתגבר על חלק ממגבלות אלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול קל וחזק כדי להרחיב Tregs התפקודי נגזר מHIV-1 אנשים נגועים במבחנה; אנחנו עוד מסבירים כיצד פנוטיפ אותם ולבדוק את התפקוד המדכא שלהם באמצעות מבחני cytometric זרימה. אנו מאמינים פרוטוקול זה יקל על גישה לTregs ועזרה בהבנת תפקידם בהתקדמות המחלה HIV-1.

Protocol

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood

1. Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube.
2. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature.
3. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical tube for 20 min at 1,200 x g with a slow start and no brakes.
4. Transfer the CD4⁺ T cell enriched PBMC layer in a new 50 ml conical tube, wash the cells by adding PBS/2% FBS and spin them down for 10 min at 1,200 x g. Then count the cells, wash again and resuspend the cells at about 20 x 10⁶/200 μl.
5. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-Phycoerythrin-Cyanine 7 (PE-Cy7) (1/100)
   anti-CD4-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (1/40)
   anti-CD25-Allophycocyanin (APC) (1/40)
   anti-CD127-Phycoerythrin (PE) (1/20)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
6. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells at 20 x 10⁶/ml in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
7. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg in X-VIVO 15 media (see gating strategy in Figure 1). Conventional T cells (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺) can be isolated and expanded as negative controls.

2. Cell Culture

1. After isolation, wash the Treg with X-VIVO 15 media.
2. Resuspend the cells at 250 x 10³/ml in X-VIVO 15 media complemented with 10% Human Serum and Penicillin-Streptomycin (50 U/ml).
3. Wash Human T-Activator CD3/CD28 beads according to manufacturer's protocol. Add beads to isolated Tregs at a ratio of 1:1 bead per cell.
4. After two days of culture, double the media volume and add IL-2 (300 U/ml).
5. Culture the Tregs for 2 weeks. Change media (X-VIVO 15/Human serum/P/S/IL-2) at days 5, 7, 9, 12. Add beads at a 1:1 ratio at day 9. When changing media, keep cells at 250 x 10³/ml.

3. Phenotyping

At the end of the expansion culture, expanded CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg can be phenotyped by flow cytometry and compared to expanded CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺ conventional T cells as a control.

1. Harvest expanded Tregs/Tconvs and wash them in PBS. Label dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
2. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-Qdot-655 (1/200)
   anti-CD25-PECy5 (1/100)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
3. Wash the cells and perform the intracellular staining using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set according to manufacturer's protocol and the following antibodies:
   anti-FOXP3-PE (1/50)
   anti-HELIOS-FITC (1/40)
   anti-CTLA4-APC (1/20)
   Acquire the data on a flow cytometer.

4. Suppression Assay

At the end of the expansion culture, the suppressive function i.e. the capacity of the expanded Treg isolated from HIV-1 positive individuals to suppress the proliferation of activated T cells can be assessed in vitro.

1. Thaw autologous cryopreserved ex vivo PBMCs. Leave them for about 3 hr in a 37 °C incubator in RPMI 1640 medium containing penicillin/streptomycin, L-glutamine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (=R+ media), and 10% FBS (=R10 media).
2. Label the dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to the manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
3. Incubate the cells with anti-CD3-PECy7 for 30 min in the dark at 4 °C. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
4. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the viable CD3+ T cells in R10 media.
5. Label the T cells with a cell tracing reagent such as CellTrace Violet or Vybrant CFDA SE Cell Tracer at 5 μM diluted in PBS for 7 min at 37 °C according to the manufacturer's protocol. Resuspend cells in R+ media supplemented with 10% human serum (=hR10 media) at 1 x 10⁶/ml.
6. Harvest the expanded Tregs, resuspend the cells at 0.5 x 10⁶/ml in hR10 and prepare dilutions at 0.25 x 10⁶/ml and 0.125 x 10⁶/ml.
7. Prepare anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28 microbeads according to the manufacturer's protocol, resuspend the microbeads at 0.75 x 10⁶/ml and prepare dilutions at 0.625, 0.562, 0.5 x 10⁶/ml in hR10 media.
8. In a 96 wells round bottom plate, transfer cells and beads according to the following plan:

T cells:Treg ratio	1:0	1:1/2	1:1/4	1:1/8
T cells (50 μl)	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml
Tregs (50 μl)	no	0.5 x 106/ml	0.25 x 106/ml	0.125 x 106/ml
Beads (100 μl)	0.5 x 106/ml	0.75 x 106/ml	0.625 x 106/ml	0.562 x 106/ml
hR10 (50 μl)	yes	no	no	no
i.e.
T cells	50 x 103	50 x 103	50 x 103	50 x 103
Tregs	0	25 x 103	12.5 x 103	6.25 x 103
Beads	50 x 103	75 x 103	62.5 x 103	56.25 x 103

9. After 4 days of culture, wash the cells and incubate them for 30 min at 4 °C with the following antibodies:
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-APC (1/100)
   anti-CD8-AF700 (1/100)

Acquire the data on a flow cytometer. Use the FlowJo proliferation platform to calculate the percentage of divided cells.

תוצאות

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations ¹³ and have been shown to correlate with CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Tregs ^9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti...

Discussion

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) ¹⁵, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	Stemcells technologies	15062
PBS	Sigma	D8537
FBS	Sigma	F4135
Histopaque	Sigma	H8889
Anti-CD3-PECy7	BD Pharmingen	557851
Anti-CD4-FITC	eBioscience	11-0049-42
Anti-CD25-APC	eBioscience	17-0259-42
Anti-CD127-PE	BD Pharmingen	557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh	BD Falcon	352235
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30-001-Cl
Human Serum	Gemini Bio-Products	100-512
Human T-activator CD3/CD28	Life Technologies	111.31D
IL-2	NIH Aids Research Reference Reagent Program	136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Life technologies	L34955
Anti-CD4-qdot-655	Life Technologies	Q10007
Anti-CD25-PECy5	eBiosciences	15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	eBiosciences	00-5523-00
Anti-FOXP3-PE	eBiosciences	12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC	Biolegend	137204
Anti-CTLA4-APC	BD Pharmingen	555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Life Technologies	V12883
HEPES	Mediatech	25-060-Cl
Treg Suppression inspector	Miltenyi Biotec	130-092-909
Anti-CD4-APC	BD Pharmingen	340443
Anti-CD8-AF700	BD Pharmingen	557945
RPMI 1640	Sigma	R0883
Glutamine	Mediatech	25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD)	Becton, Dickinson and Company (BD)	364606
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences	-
LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences	-
FlowJo	Tree Star	v887