새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

요약

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

초록

CD4 + 조절 T 세포 (Tregs의)는 강력한 면역 변조기이며, 인간의 면역 항상성에 중요한 기능을 제공합니다. Tregs의 고갈은 암과 전염성 병원균에 대한 백신 설정에서 항원 특이 T 세포 반응의 측정이 증가하게되었다. 그들은 하나 해로운 HIV-1과 연관된 면역 활성을 억제하는 역할을하기 때문에 HIV-1 질병의 진행을 느리게하거나 또는 HIV-1 특이 면역을 억제함으로써 바이러스를 촉진 할 수 그러나, HIV-1 면역 기전에서의 역할은 논란이 남아있다 확산. 이해와 HIV-1의 맥락에서 변조 Treg 기능은 면역 또는 HIV 백신에 대한 잠재적 인 새로운 전략으로 이어질 수 있습니다. 그러나 중요한 질문을주의 깊게 연구 할 필요가 HIV-1 감염의 맥락에서 자신의 역할에 남아 있습니다.

Treg 인구 공부, 인간 CD4 + 말초 혈액에서 T 세포의 약 5 %를 대표하는 에스 어려운 것으로 입증되었습니다pecially HIV-1 관련 CD4의 T 세포 HIV-1에 감염된 사람들과 함께하는 Treg 고갈이 발생합니다. 고급 HIV-1 질병이나 조직 샘플은 단지 매우 작은 생물 학적 샘플을 얻을 수있는, 그러므로 매우 어려운과 개인의 규제 T 세포의 특성. 우리는 HIV-1 양성 개인의 Tregs의의 분리 및 확장을 사용하여 이러한 한계를 극복 할 수있는 기술적 인 해결책을 제안한다.

여기에서 우리는 성공적으로 체외에서 HIV-1에 감염된 개인으로부터 Tregs의 격리를 확장 할 수있는 쉽고 강력한 방법을 설명합니다. 흐름 분류 CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^낮은 Tregs의이 anti-CD3/anti-CD28 코팅 구슬로 자극하고 IL-2의 면전에서 배양 하였다. 확장 Tregs의이 FOXP3 높은 수준의 CTLA4를 표현 HELIOS 기존의 T 세포에 비해 매우 억압적인 것으로 보였다. Tregs의 큰 숫자에 쉽게 접근 연구자가 난을 해결하기 위해 수HIV-1 immunopathogenesis에서 자신의 역할에 관한 mportant 질문입니다. 우리는이 질문에 대답하는 것은 효과적인 HIV-1 백신의 개발에 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 믿습니다.

서문

HIV / AIDS 전세계 새롭게 2011 년에 감염 추정 2백50만명, 세계 에이즈 전염병을 억제하는 효과적인 HIV 백신에 대한 필요성과 함께 생활 이상의 3400 만 개인과 중요 남아 있습니다. 그러나 강렬한 연구 노력의 년간에도 불구하고, 현재까지 HIV-1 백신 효능 시험은 겸손 보호를 ^1-3로 이어질 및 보호 면역의 상관 관계를 제대로 이해 남아 있습니다. 보호에 필요한 면역 반응의 특성을 해명하는 것은 효과적인 HIV-1 백신과 HIV-1 감염을 대상으로 다른 immunotherapeutic 전략의 전략적 설계를위한 필수적입니다.

자연적인 CD4 + 조절 T 세포 (Tregs의)는 따라서 면역 - 매개 조직의 손상을 제한, 과도한 면역 활성을 조절하여 면역 세포의 항상성 유지에 중요하다. 그러나, 그들은 또한 병원균에 대한 면역 반응을 억제하고 자신의 통관을 방지 할 수 있습니다. 암과 헤파titis B 백신 연구는 Tregs의의 활동을 감소하는 백신 반응과 바이러스에 ^4-7에 대한 항원 특이 면역을 향상시킬 수 있음을 증명하고있다. 그러나 HIV-1 감염의 맥락에서, 규제 T 세포의 정확한 영향은 불완전하게 이해 남아있다. Tregs의이 활성화 된 T 세포 ⁸ 바이러스 복제를 감소 그리고 아마도 면역 활성화 ⁹ 영향을 표시했다. 그들은 또한 질병의 진행 ^10,11에 대한 부정적인 결과가있을 수 HIV-1 특이 면역 반응을 억제하기 위해 표시되었습니다. 따라서, HIV-1 백신의 효능을 강화하는 Treg 활동을 조절 할 수되기 전에,이 질병의 맥락에서 그들의 기능에 추가 통찰력을 얻을 것이 중요합니다.

인간 CD4 + 조절 T 세포는 약 5 CD4의 % + 말초 혈액에서 T 세포, 그리고 추가로 절대 숫자 HIV-관련 CD4 + T 세포 고갈 ^12와 감소를 나타내는 상대적으로 부족한 세포 인구입니다 ^</>을 먹다. 공동 문화를 Treg와 같은 T 세포 증식 분석으로 Treg 기능을 평가하는 현재의 분석은 비교적 큰 세포 수에게 ^12을 사용합니다. 따라서 진보와 개인에 규제 T 세포의 기능과 특이성을 특성화 HIV-1 질병은 HIV 병인에 대한 자신의 중요성에도 불구하고, 도전하고있다.

HIV-1 환자에서 Tregs의의 생체 분리 및 확장은 이러한 제한을 극복 할 수있는 솔루션을 나타낼 수 있습니다. 여기에서 우리는 체외에서 HIV-1에 감염된 사람에서 파생 된 기능 Tregs의 검색을 확장 할 수있는 쉽고 강력한 프로토콜을 설명합니다, 우리는 더 이상 어떻게 표현형을 해석하고 유세포 분석을 사용하여 억제 기능을 테스트합니다. 우리는이 프로토콜은 Tregs의 접근을 용이하게하고 HIV-1 질병의 진행에서 자신의 역할을 이해하는 데 도움이됩니다 믿습니다.

프로토콜

1. Regulatory T cell isolation from HIV-1 Positive Blood

1. Carefully transfer blood, collected in ACD tubes, into a 50 ml conical tube for a final volume of 15 ml blood per tube.
2. Add 25 μl/ml of blood of RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail, mix carefully and incubate 20 min at room temperature.
3. Add 15 ml of PBS/2% FBS to the blood and mix carefully. Layer the diluted blood sample on top of 15 ml of Histopaque at room temperature in a 50 ml conical tube. Spin the conical tube for 20 min at 1,200 x g with a slow start and no brakes.
4. Transfer the CD4⁺ T cell enriched PBMC layer in a new 50 ml conical tube, wash the cells by adding PBS/2% FBS and spin them down for 10 min at 1,200 x g. Then count the cells, wash again and resuspend the cells at about 20 x 10⁶/200 μl.
5. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-Phycoerythrin-Cyanine 7 (PE-Cy7) (1/100)
   anti-CD4-Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (1/40)
   anti-CD25-Allophycocyanin (APC) (1/40)
   anti-CD127-Phycoerythrin (PE) (1/20)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
6. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells at 20 x 10⁶/ml in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
7. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg in X-VIVO 15 media (see gating strategy in Figure 1). Conventional T cells (CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺) can be isolated and expanded as negative controls.

2. Cell Culture

1. After isolation, wash the Treg with X-VIVO 15 media.
2. Resuspend the cells at 250 x 10³/ml in X-VIVO 15 media complemented with 10% Human Serum and Penicillin-Streptomycin (50 U/ml).
3. Wash Human T-Activator CD3/CD28 beads according to manufacturer's protocol. Add beads to isolated Tregs at a ratio of 1:1 bead per cell.
4. After two days of culture, double the media volume and add IL-2 (300 U/ml).
5. Culture the Tregs for 2 weeks. Change media (X-VIVO 15/Human serum/P/S/IL-2) at days 5, 7, 9, 12. Add beads at a 1:1 ratio at day 9. When changing media, keep cells at 250 x 10³/ml.

3. Phenotyping

At the end of the expansion culture, expanded CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg can be phenotyped by flow cytometry and compared to expanded CD3⁺CD4⁺CD25^-CD127⁺ conventional T cells as a control.

1. Harvest expanded Tregs/Tconvs and wash them in PBS. Label dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
2. Add the following antibodies (concentration):
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-Qdot-655 (1/200)
   anti-CD25-PECy5 (1/100)
   Incubate 30 min in the dark at 4 °C
3. Wash the cells and perform the intracellular staining using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set according to manufacturer's protocol and the following antibodies:
   anti-FOXP3-PE (1/50)
   anti-HELIOS-FITC (1/40)
   anti-CTLA4-APC (1/20)
   Acquire the data on a flow cytometer.

4. Suppression Assay

At the end of the expansion culture, the suppressive function i.e. the capacity of the expanded Treg isolated from HIV-1 positive individuals to suppress the proliferation of activated T cells can be assessed in vitro.

1. Thaw autologous cryopreserved ex vivo PBMCs. Leave them for about 3 hr in a 37 °C incubator in RPMI 1640 medium containing penicillin/streptomycin, L-glutamine, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer (=R+ media), and 10% FBS (=R10 media).
2. Label the dead cells using the LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit according to the manufacturer's protocol. Wash the cells in PBS/2% FBS.
3. Incubate the cells with anti-CD3-PECy7 for 30 min in the dark at 4 °C. Wash the cells with PBS/2% FBS. Resuspend the cells in PBS/2% FBS and filter them on a 35 μm nylon mesh.
4. Using a FACS Aria cell sorter equipped for handling biohazardous material, sort the viable CD3+ T cells in R10 media.
5. Label the T cells with a cell tracing reagent such as CellTrace Violet or Vybrant CFDA SE Cell Tracer at 5 μM diluted in PBS for 7 min at 37 °C according to the manufacturer's protocol. Resuspend cells in R+ media supplemented with 10% human serum (=hR10 media) at 1 x 10⁶/ml.
6. Harvest the expanded Tregs, resuspend the cells at 0.5 x 10⁶/ml in hR10 and prepare dilutions at 0.25 x 10⁶/ml and 0.125 x 10⁶/ml.
7. Prepare anti-CD2/anti-CD3/anti-CD28 microbeads according to the manufacturer's protocol, resuspend the microbeads at 0.75 x 10⁶/ml and prepare dilutions at 0.625, 0.562, 0.5 x 10⁶/ml in hR10 media.
8. In a 96 wells round bottom plate, transfer cells and beads according to the following plan:

T cells:Treg ratio	1:0	1:1/2	1:1/4	1:1/8
T cells (50 μl)	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml	1 x 106/ml
Tregs (50 μl)	no	0.5 x 106/ml	0.25 x 106/ml	0.125 x 106/ml
Beads (100 μl)	0.5 x 106/ml	0.75 x 106/ml	0.625 x 106/ml	0.562 x 106/ml
hR10 (50 μl)	yes	no	no	no
i.e.
T cells	50 x 103	50 x 103	50 x 103	50 x 103
Tregs	0	25 x 103	12.5 x 103	6.25 x 103
Beads	50 x 103	75 x 103	62.5 x 103	56.25 x 103

9. After 4 days of culture, wash the cells and incubate them for 30 min at 4 °C with the following antibodies:
   anti-CD3-PECy7 (1/100)
   anti-CD4-APC (1/100)
   anti-CD8-AF700 (1/100)

Acquire the data on a flow cytometer. Use the FlowJo proliferation platform to calculate the percentage of divided cells.

결과

The expression of interleukin 2 receptor (CD25) and the interleukin 7 receptor (CD127) have been described as reliable surface markers to identify functional Treg populations ¹³ and have been shown to correlate with CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Tregs ^9,12. Figure 1 represents the gating strategy used to flow-sort single CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^low Tregs from PBMC isolated from an HIV-1-positive individual. The CD25/CD127 anti...

토론

Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) ¹⁵, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	Stemcells technologies	15062
PBS	Sigma	D8537
FBS	Sigma	F4135
Histopaque	Sigma	H8889
Anti-CD3-PECy7	BD Pharmingen	557851
Anti-CD4-FITC	eBioscience	11-0049-42
Anti-CD25-APC	eBioscience	17-0259-42
Anti-CD127-PE	BD Pharmingen	557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh	BD Falcon	352235
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
Penicillin/Streptomycin	Mediatech	30-001-Cl
Human Serum	Gemini Bio-Products	100-512
Human T-activator CD3/CD28	Life Technologies	111.31D
IL-2	NIH Aids Research Reference Reagent Program	136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Life technologies	L34955
Anti-CD4-qdot-655	Life Technologies	Q10007
Anti-CD25-PECy5	eBiosciences	15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	eBiosciences	00-5523-00
Anti-FOXP3-PE	eBiosciences	12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC	Biolegend	137204
Anti-CTLA4-APC	BD Pharmingen	555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit	Life Technologies	C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit	Life Technologies	V12883
HEPES	Mediatech	25-060-Cl
Treg Suppression inspector	Miltenyi Biotec	130-092-909
Anti-CD4-APC	BD Pharmingen	340443
Anti-CD8-AF700	BD Pharmingen	557945
RPMI 1640	Sigma	R0883
Glutamine	Mediatech	25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD)	Becton, Dickinson and Company (BD)	364606
FACSAria IIu Cell Sorter	BD Biosciences	-
LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences	-
FlowJo	Tree Star	v887