JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تفاصيل هذه المقالة الإجراءات لتحليل التصوير البصري للجسيمات متناهية الصغر للورم المستهدفة، HerDox. على وجه الخصوص، وصفت تفاصيل استخدام جهاز التصوير المتعدد للكشف عن الورم استهداف وتقييم تغلغل الورم هنا.

Abstract

جسيمات متناهية الصغر HER2 + ورم المستهدفة، HerDox، يسلك تراكم الورم تفضيلية والاجتثاث الورم للنمو في نموذج حيواني من HER2 + سرطان. يتم تشكيل HerDox من قبل غير التساهمية التجميع الذاتي للورم استهدفت خلية البروتين اختراق مع وكيل العلاج الكيميائي، دوكسوروبيسين، عن طريق رابط صغير الحمض النووي. مزيج من بالإلكترونات، إقحام، والتفاعلات oligomerization تسهيل التجميع الذاتي في جولة 10-20 الجسيمات نانومتر. HerDox يسلك الاستقرار في الدم وكذلك في تخزين طويلة في درجات حرارة مختلفة. تسليم النظامية من HerDox في الفئران الحاملة للورم ينتج في موت خلايا الورم مع عدم وجود آثار ضارة يمكن كشفها إلى الأنسجة غير السرطانية، بما في ذلك القلب والكبد (التي تخضع الضرر تميزت دوكسوروبيسين تشتته). HER2 ارتفاع يسهل استهداف الخلايا معربا عن الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة، وبالتالي الأورام بعرض مستويات مرتفعة HER2 يحمل أكبر تراكم HerDox مقارنة اكسبريس الخلاياالغناء المستويات الدنيا، سواء في التجارب المختبرية والحية. وقد سمح التصوير كثافة مضان جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي ومتحد البؤر في الموقع لنا للتحقق من الورم في الجسم الحي استهداف واختراق الخلايا السرطانية من HerDox بعد الولادة النظامية. نحن هنا التفاصيل طرقنا لتقييم الورم عبر استهداف التصوير المتعدد بعد الولادة النظامية.

Introduction

استهداف الورم من العلاج الكيميائي لديه القدرة على القضاء على الخلايا السرطانية في جرعة أقل بالمقارنة مع الأدوية غير مستهدفة لأن أكثر من العلاج تسليمها يمكن أن تتراكم في وجهتها المقصودة بدلا من توزيعها على الأنسجة غير السرطانية. حيث أن الوضع الأخير سيضعف من فعالية الدواء وبالتالي تتطلب جرعات أعلى لتكون فعالة، استهداف الورم على حد سواء مزايا علاجية والسلامة على معيار المعاملة غير المستهدفة.

استهداف العلاج الكيميائي عن طريق التغليف في الجسيمات النانوية الذاتي تجميعها يسمح للدواء أن تظل غير معدلة كيميائيا على النقيض من الأدوية التي ترتبط تساهميا إلى جزيئات الاستهداف. على هذا النحو الربط لديه القدرة على تغيير النشاط من كل من المخدرات وجزيء الاستهداف؛ يسمح التجمع غير التساهمية فاعلية الدواء ليتم الاحتفاظ بها.

لقد أظهرنا سابقا أن الرواية ثلاثة مكونات، مجمع الذاتي تجميعها، HerDox، تستهدف HER2 + الأورام في الجسم الحي، ويتسبب الاجتثاث الورم للنمو في حين أن يجنب الأنسجة الطبيعية، بما في ذلك القلب 1. يتم تشكيل HerDox من خلال التفاعلات غير التساهمية بين مستقبلات ملزم بروتين الخلية الاختراق، HerPBK10، وكيل العلاج الكيميائي، دوكسوروبيسين (دوكس)، عبر رابط صغير الحمض النووي. HerPBK10 يربط الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة (HER) ويطلق الإلتقام مستقبلات بوساطة 2-4، في حين يتم إنجاز اختراق غشاء endosomal من خلال إدماج اتش المستمدة بينتون قاعدة قفيصة البروتين 4-6. A المجال المشحون إيجابيا على البروتين تمكن الحمض النووي ملزم 4، 5، التي من خلالها دوكس DNA-مقحم يمكن نقلها للتسليم المستهدفة. بالإلكترونات، إقحام، وربما تفاعلات البروتين oligomerization تسهيل التجميع الذاتي في جولة 10-20 نانومتر الجزيئات التي هي مستقرة في الدم وتحت الموسعة التخزين عند درجات حرارة مختلفة 1. التفضيلية التي تستهدف لهاومما يسهل 2 + خلايا الورم عن طريق تقارب يجند المحسن عندما يتم رفع HER2.

وقد أظهرت دراساتنا السابقة أن تسليم النظامية من غلة HerDox تراكم تفضيلي في الأورام أكثر من الأنسجة غير السرطانية وبالمقارنة مع تشتته دوكس 1، وتغلغل في الخلايا السرطانية في الجسم الحي 7. وقد لاحظنا أن إطلاق HerDox دوكس بعد دخول الخلايا السرطانية، مما يتيح تراكم دوكس في نواة 1. يظهر ورم تراكم للربط مع مستوى مستقبلات، مثل الأورام HER2، معربا عن منخفض نسبيا تتراكم أقل HerDox مقارنة مع الذين لديهم مستويات أعلى نسبيا HER2 1. وعلاوة على ذلك، فإن التركيز الفعال موت الخلايا يسلك جود علاقة عكسية مع HER2 العرض على خطوط الخلايا السرطانية معربا عن اختلاف سطح الخلية HER2 مستويات 1. HerDox يسلك ميزة العلاجية والسلامة على دوكس تشتته، كما يحدث قتل الورم في أكثر من جرعة أقل 10 مرات مقارنة untarالمخدرات geted وينتج أي تأثير سلبي للكشف على القلب (الكشف عن ضربات القلب والنسيجية وصمة عار) أو الكبد (الكشف عن النفق وصمة عار) الأنسجة، وعلى النقيض من تشتته دوكس 1. على الرغم من الاشتقاق من البروتين قفيصة الفيروسية، يسلك HerPBK10 لا المناعية للكشف على المستويات العلاجية 2. بينما الأجسام المضادة الموجودة من قبل لاتش كله يمكن التعرف HerPBK10، أنهم غير قادرين على منع الخلية ملزم 2.

يقاس حجم الورم مع مرور الوقت هو الطريقة القياسية لتقييم الكفاءة العلاجية من العلاجات المستهدفة، واستخدمت لتقييم الكفاءة العلاجية من HerDox. وقد سمح هذا النهج مع المكمل في الجسم الحي وخارج الحي مضان التصوير كثافة لنا لتقييم أفضل استهداف كفاءة 7. قمنا بدمج تحديدا التصوير متحد البؤر الموقع من الأورام مع رفعه في التحليل الطيفي للدوكس مضان للتحقق من أن لا HerDoxر تراكمت فقط في الأورام في الجسم الحي ولكن توغلوا في خلايا الورم ودوكس تسليمها إلى السيتوبلازم والنواة 7. وعلاوة على ذلك التحليل الطيفي مكن لنا أن نميز بين دوكس مضان من تألق ذاتي 7.

نحن هنا لشرح بمزيد من التفصيل نهجنا لتقييم HerDox في الجسم الحي بعد الولادة النظامية، والأهم من ذلك، لتقييم الاستهداف من خلال أساليب التصوير المتعدد والتحليلات.

Protocol

1. النظامية التسليم في الجسم الحي

  1. خلط ما يكفي HerDox مع ملحي معقم لمساواة 0.2 مل من 0.004 ملغ / كغ جرعة من HerDox في حقن ل6-8 أسبوع من العمر NU / NU الماوس واضعة تحت الجلد الأورام طعم أجنبي الجهة الثنائية.
  2. رسم بلطف الخليط HerDox إلى حقنة الانسولين 3/10 سم مكعب مزودة إبرة 29G، وتجنب الفقاعات.
  3. وبفعل التخدير عن طريق التعرض isoflurane وجيزة في غرفة الاستقراء مجهزة بنظام الكسح الغاز (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 3-4٪ (أو أقل).
  4. حقن الخليط كله في الوريد ذيل الماوس تخدير (0.2 مل لكل حقن). ويمكن أيضا حقن IV أن يؤديها في ضبط النفس، والماوس unanesthetized.
  5. تكرار الحقن في نفس الماوس لمدة ستة أيام أكثر متتابعة، مرة واحدة يوميا.

2. التصوير مضان في الجسم الحي

تراكم HerDox مضان في الأورام يمكنيتم كشفها بواسطة اليوم الأخير من حقن (يوم 7) باستخدام جهاز تصوير المتعدد. الإجراءات أدناه ينطوي على استخدام A-إضاءة الكلي والكشف عن نظام حسب الطلب (الشكل 1) 8.

  1. بدوره على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  2. تحديد الانبعاثات ممر الموجة مرشح (590 نانومتر ± 30 نانومتر) مناسبة للدوكسوروبيسين مضان الكشف.
  3. بدوره على الأرجون ليزر كريبتون-ووضع ممر الموجة مرشح الإثارة (488 نانومتر ± 10 نانومتر) في مسار بصري ليزر.
  4. بدوره على نظام التخدير وثم ضع الماوس في غرفة التخدير (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 3-4٪ (أو أقل) مجهزة بنظام الكسح الغاز.
  5. نقل الماوس من غرفة التخدير إلى غرفة التصوير من المتعدد في الجسم الحي تصوير الضوئي عند الفأر هو تخدير.
  6. وضع الرؤوس على الأنف من الفأرة وافتح تدفق لإدارة تخدير المستمرSIA خلال الحصول على الصور (معدلات تدفق الأوكسجين: 0.5-1 لتر / دقيقة، وتركيز isoflurane و: 2-3٪ (أو أقل).
  7. الحصول على صور مضان باستخدام ومدة التعرض من 5-15 ثانية.
  8. إجراء تحليل الصور ومعالجتها بما في ذلك تصحيح الخلفية أو تعديل التباين.

3. مضان التصوير خارج الحي

HerDox مضان ولا يمكن تصوير في الأورام وأجهزة محددة (بما في ذلك الكبد والكلى والطحال والقلب والعضلات والهيكل العظمي) تحصد من الفئران الموت الرحيم في 24 ساعة بعد (يوم 7) حقن النهائي من HerDox.

  1. بدوره على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  2. تحديد الانبعاثات ممر الموجة مرشح (580 نانومتر ± 20 نانومتر) لدوكسوروبيسين الكشف عن مضان.
  3. بدوره على الأرجون ليزر كريبتون-ووضع ممر الموجة مرشح الإثارة (488 نانومتر ± 10 نانومتر) في مسار بصري ليزر.
  4. مكان الأورام وأجهزة معينة رتبت على طبق بيتري في غرفة التصوير Oو على المتعدد في تصوير بصري الجسم الحي.
  5. الحصول على صور مضان من الأنسجة باستخدام ومدة التعرض من 5-15 ثانية. ويرد مثال من الحصول على الصور مضان الأولي في الشكل 2A. تكرار نفس باستخدام بيتري طبق فارغ، والذي سيكون بمثابة الخلفية (الشكل 2B).
  6. إجراء تحليل الصور ومعالجتها بما في ذلك تصحيح الخلفية أو تعديل التباين. ويرد مثال لصورة تصحيحه في الشكل 2C، الناتجة عن الطرح من الشكل 2B 2A من الشكل.

4. في مجال التصوير متحد البؤر الموقع من الأورام

في مجال التصوير متحد البؤر الموقع يسمح الكشف والتحليل من تراكم الورم HerDox على المستوى الخلوي.

  1. بدوره على لايكا SPE متحد البؤر المجهر.
  2. حدد 488 نانومتر ضوء الليزر لإثارة دوكسوروبيسين وانبعاث موجات (560-620 نانومتر) لدوكسوروبيسينالكشف عن مضان.
  3. حدد الهدف 40X 63X أو وانخفاض النفط الغمر على العدسة الهدف.
  4. استخراج أورام جديدة من الفئران الموت الرحيم التي تلقت سابقا العلاجات HerDox وهمية كما هو موضح في الإجراء 2.
  5. مكان الأورام على طبق بيتري على الجليد لتجنب تدهور الأنسجة، ومن ثم نقل الأورام إلى T غرفة الدلتا للتصوير متحد البؤر.
  6. الحصول على صور متحد البؤر من الأورام في أعماق تنسيق متسلسلة (حجم الخطوة: 1 ميكرون، وسمك: 20 ميكرون). ويرد مثال من الصور بالتتابع المكتسبة على طول المحور Z في الشكل 3، لوحة اليسار.
  7. أداء أقصى كثافة Z-الإسقاط من الصور. ويرد أقصى الإسقاط كثافة Z-مكدسة الصور في الشكل 3، اللوحة اليمنى.
  8. حساب يعني كثافة مضان من الحد الأقصى للكثافة Z - صور الإسقاط متوسط ​​كثافة مضان من الصور على الحقل العام للرأي تم حسابد باستخدام يماغيج.

5. التصوير الطيفي Ratiometric وتحليل

التصوير الطيفي Ratiometric وتحليل يسمح التمييز بين دوكس مضان وتألق ذاتي.

  1. الطاقة على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مضان.
  2. الحصول على 15 صور للأورام المعالجة وغير المعالجة HerDox على عمق محدد ضمن النطاق الطيفي من 510-650 نانومتر، مع حجم خطوة من 10 نانومتر، والإثارة في 488 نانومتر باستخدام ضوء لايكا SPE المجهر متحد البؤر.
  3. يعد حل ميكرومتر 100 من دوكسوروبيسين.
  4. أداء التصوير الطيفي للميكرومتر حل 100 دوكسوروبيسين للحصول على البصمة الطيفية نقية من دوكس مضان (المدى الطيفي: 510-650 نانومتر، حجم الخطوة: 10 نانومتر). تآمر نتائج نموذجية من الحصول على الصور من التصوير الطيفي والناتجة الطيف مضان حيث يتم إظهارها على الرسم البياني في الشكل (4).
  5. الحصول على البصمة الطيفية تألق ذاتي من صورة جيوب (المدى الطيفي: 510-650 نانومتر، حجم الخطوة: 10 نانومتر) التي تم الحصول عليها عن طريق التصوير الطيفي للأورام غير المعالجة. تآمر نتائج نموذجية من الحصول على الصور من التصوير الطيفي والناتجة الطيف مضان حيث يتم إظهارها على الرسم البياني في الشكل 5.
  6. توليد أربعة طيفية المرجعية (تألق ذاتي محض، 0.1.doxorubin +0.9. تألق ذاتي، 0.2. دوكسوروبيسين +0.8. تألق ذاتي، 0.3.doxorubin +0.7. تألق ذاتي) باستخدام برنامج قمنا بتطوير 9. ويرد منحنى نموذجي تظهر أربعة طيفية إشارة في الشكل (6).
  7. أداء تصنيف الطيفية من الصور على النحو الذي حدده طيفية إشارة من خلال قياس المسافة الإقليدية باستخدام البرنامج الذي وضعت سابقا 9.
  8. أداء unmixing الطيفية خطي من تلك الصور باستخدام برنامج الطيفية unmixing (المكونات في في ImageJ) وضعنا 7، 10، للمقارنة إلى التصوير الطيفي ratiometric والتحليل. بريدويرد xample فصل مضان HerDox من تألق ذاتي من قبل unmixing الطيفية الخطي في الشكل 7.

النتائج

ويبين الشكل 1 في الجسم الحي النموذج تصوير الضوئي، التي بنيت لغرض الحصول على الصور تحت طرائق متعددة، بما في ذلك كثافة مضان، الطيفية، والعمر، 2 الفوتون، متحد البؤر داخل الحيوية، والتصوير تلألؤ بيولوجي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تبريد الكاميرا حساسية عالية و...

Discussion

دوكس مضان يمكن كشفها في الجسم الحي باستخدام تصوير المتعدد عندما الأورام تحت الجلد. ومع ذلك، فإن جرعة علاجية فعالة من HerDox (0.004 ملغ / كلغ) تحت عتبة الكشف بعد جرعة واحدة. في المقابل، بعد 7 حقن يومية (1x/day لمدة 7 أيام)، وتراكم الورم والإبقاء على الجسيمات كافية لتمكين التص?...

Disclosures

المؤلف، دانيال فاركاس، هو رئيس مجلس إدارة التصوير الجزيئي الطيفي. الكتاب المتبقية ليس لها المصالح المتنافسة.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة إلى LKM-K من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان (R01CA129822 وR01CA140995). د. المدينة المنورة، وذلك بفضل C. Kauwe ري، M. M-Kauwe وD. Revetto لاستمرار الدعم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fluorescence laser scanning confocal microscopeLeicaSPE
In Vivo Optical ImagerSpectral Molecular ImagingMultimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HClSigma-AldrichD4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 weekCharles RiverStrain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cellsNCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needleBD309301
Delta T chamber Bioptechs04200417B

References

  1. Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
  2. Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
  3. Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
  4. Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
  5. Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
  6. Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
  7. Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).
  8. Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).
  10. Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. . Biomedical Optical Imaging. , (2009).
  11. Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
  12. Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).
  13. Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 HerDox HER HER2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved