Gezielte Analyse von viralen Proteins Nanopartikel HER2 + Tumoren Lieferung

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren für die optische Bildgebung Analyse der Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox. Insbesondere wird eine detaillierte Verwendung der Multimode-Bildaufnahmevorrichtung zum Erfassen Tumor-Targeting und Bewertung Tumorpenetration beschrieben.

Zusammenfassung

Der HER2 + Tumor-Targeting-Nanopartikel, HerDox weist Tumor-und Tumor-Akkumulation bevorzugte Wachstum Ablation in einem Tiermodell der HER2 + Krebs. HerDox durch nichtkovalente Selbstorganisation eines Tumors Zielzelle Penetrationsprotein mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin ausgebildet ist, über eine kleine Nukleinsäure Linker. Eine Kombination von elektrophilen, Einlagerung und Oligomerisierung Interaktionen erleichtern self-assembly in runde 10-20 nm großen Partikeln. HerDox aufweist Stabilität im Blut sowie einer längeren Lagerung bei verschiedenen Temperaturen. Systemische Abgabe HerDox in tumortragenden Mäusen zur Tumor-Zelltod ohne feststellbare nachteilige Auswirkungen auf Nicht-Tumor-Gewebe, einschließlich des Herzens und der Leber (der unterziehen gekennzeichnet Schäden durch ungezielte Doxorubicin). HER2 Höhe erleichtert Targeting von Zellen, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, damit Tumoren Anzeige erhöhten HER2 Ebenen größere Ansammlung von HerDox weisen im Vergleich zu Zellen, Expressionsingen unteren Ebenen, sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzintensität Bildgebung mit in situ konfokalen und Spektralanalyse kombiniert hat uns erlaubt, in vivo Tumor-Targeting und Tumorzelle Eindringen von HerDox nach systemischer Lieferung überprüfen. Hier haben wir ausführlich unsere Methoden zur Beurteilung der Tumor-Targeting über Multimode-Bildgebung nach systemischer Lieferung.

Einleitung

Tumor-Targeting der Chemotherapie hat das Potenzial, Krebszellen zu niedrigeren Dosis im Vergleich zu beseitigen ungezielte Drogen, weil mehrere gelieferte Therapie am Bestimmungsort anstatt zu verteilen, um Nicht-Tumorgewebe ansammeln können. Da dieser Situation verdünnen sich die Wirksamkeit des Arzneimittels und somit höhere Dosen wirksam zu sein, hat Tumor-Targeting sowohl therapeutische als auch sicherheitstechnische Vorteile gegenüber herkömmlichen nicht-zielgerichtete Behandlung.

Targeting Chemotherapie durch Verkapselung in selbstorganisierte Nanopartikel ermöglicht das Medikament zu bleiben chemisch im Gegensatz zu Medikamenten, die kovalent an Targeting-Moleküle gebunden sind unverändert. Als solche Verbindung hat das Potential, die Aktivität von sowohl dem Wirkstoff und dem Zielmolekül zu ändern; nichtkovalente Anordnung ermöglicht Arzneistoffwirksamkeit beibehalten werden.

Wir haben bereits gezeigt, dass das neue Drei-Komponenten, self-assembled komplex, HerDox, HER2 + Tumoren zielt In vivo und entlockt Tumor-Wachstum Ablation unter Schonung gesunden Gewebes, einschließlich des Herzens ^1. HerDox durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Rezeptor-Bindungs-Zelle Penetrationsprotein, HerPBK10 und des chemotherapeutischen Mittels gebildet, Doxorubicin (DOX), über eine kleine Nukleinsäure Linker. HerPBK10 bindet den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) und löst Rezeptor-vermittelte Endozytose ^2-4, während endosomalen Membran Penetration durch Einbau des Adenovirus-abgeleiteten Pentonbasis Kapsidprotein ^4-6 erreicht wird. Eine positiv geladene Domäne des Proteins ermöglicht Nukleinsäurebindung ^{4, 5,} durch die DNA-interkalierten Dox zum gezielten Transport transportiert werden können. Elektrophile, Einlagerung und möglicherweise Protein-Interaktionen erleichtern Oligomerisierung Selbstorganisation zu rund 10-20 nm großen Partikeln, die stabil sind in Blut und unter längerer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen ^1. Bevorzugte Targeting HER2 + Tumorzellen durch die erhöhte Ligandenaffinität erleichtert, wenn HER2 erhöht ist.

Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass die systemische Verabreichung von HerDox Ausbeuten bevorzugte Anreicherung in Tumoren über Nicht-Tumorgewebe und im Vergleich zu Dox ¹ und Eindringen in Tumorzellen ungezielte in vivo ^7. Wir haben beobachtet, dass HerDox Veröffentlichungen Dox nach Tumorzelle Eintrag, so dass Dox Akkumulation in den Zellkern ^ein. Tumor-Akkumulation erscheint mit Rezeptor korrelieren, als relativ gering HER2-positive Tumoren anreichern weniger HerDox Vergleich zu denen mit vergleichsweise höheren HER2 Stufen ^1. Darüber hinaus zeigt die effektive Konzentration Zelltod eine inverse Korrelation mit HER2 Anzeige auf Tumor-Zelllinien unterschiedlicher Zelloberfläche HER2-Stufen ^1. HerDox zeigt eine therapeutische Sicherheit und Vorteil gegenüber ungezielte Dox, wie Tumorabtötung tritt bei über 10-mal niedriger Dosis im Vergleich zum entpackengeted Wirkstoff und zeigt keine nachweisbare negative Wirkung auf Herz (nachgewiesen durch Echokardiographie und histologische Färbung) oder Leber (nachgewiesen durch TUNEL-Färbung) Gewebe, im Gegensatz zu ungezielte Dox ^1. Trotz seiner Herkunft aus einer Virushülle Protein weist HerPBK10 keine nachweisbare Immunogenität im therapeutischen Bereich ^2. Während bereits vorhandenen Antikörper zu ganzen Adenovirus HerPBK10 erkennen können, sind sie nicht in der Lage Zellbindung ² zu verhindern.

Tumorvolumen über die Zeit gemessen wird, eine Standard-Methode zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit einer Therapie erfolgen und ist für die Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von HerDox eingesetzt. Ergänzend diesen Ansatz mit in vivo und ex vivo Fluoreszenz Bildgebung hat uns erlaubt, besser zu beurteilen Targeting Effizienz ^7. Wir haben insbesondere in situ konfokale Abbildung entfernten Tumoren mit Spektralanalyse Dox Fluoreszenz integriert, dass keine Verifizierung HerDoxt nur bei Tumoren in vivo angesammelt aber drang in Tumorzellen und geliefert Dox in das Zytoplasma und Zellkern ^7. Spektralanalyse ermöglichte es uns, weiterhin Dox Fluoreszenz von Autofluoreszenz ⁷ unterscheiden.

Hier zeigen wir näher unser Ansatz für die Beurteilung HerDox in vivo nach systemischer Lieferung, und vor allem für die Beurteilung durch Targeting Multimode bildgebende Verfahren und Analysen.

Protokoll

1. Systemische Lieferung In vivo

1. Mischen genug mit steriler Kochsalzlösung HerDox bis 0,2 ml einer 0,004 mg / kg Dosis HerDox pro Injektion eine 6-8 Wochen alten nu / nu-Maus, die subkutan bilateral Flanke Xenograft gleichzusetzen.
2. Vorsichtig ziehen die HerDox Mischung in eine 3/10 cc Insulinspritze mit einer 29G Nadel ausgestattet Blasenbildung vermeiden.
3. 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) Anästhesie wird durch kurze Exposition Isofluran in einer Induktion Kammer mit einem Gas Spülsystem (Oxygen Flussraten ausgestattet induziert.
4. Injizieren Sie die gesamte Mischung in die Schwanzvene einer narkotisierten Maus (0,2 ml pro Injektion). IV Injektion kann auch in einer zurückhaltenden, narkotisierten Maus durchgeführt werden.
5. Wiederholen Injektionen am selben Maus für sechs aufeinander folgenden Tagen, einmal pro Tag.

2. Fluorescence Imaging in vivo

Die Anhäufung von HerDox Fluoreszenz in Tumorenwerden bis zum letzten Tag der Injektion (Tag 7) mit einem Multimode-Imager nachweisbar. Die folgenden Verfahren beinhalten die Verwendung eines kundenspezifischen Makro-Beleuchtung und Detektion (Abbildung 1) ^8.

1. Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager.
2. Wählen Sie eine Emission Bandpassfilter (590 nm ± 30 nm) für Doxorubicin Fluoreszenz-Detektion geeignet.
3. Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang.
4. Schalten Sie den Anästhesie-System und legen Sie dann eine Maus in die betäubende Kammer (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 3-4% (oder weniger) mit einem Gas-Spülung ausgestattet.
5. Übertragen Sie die Maus aus der betäubende Kammer zur Bildgebung Kammer des Multimode Optical In-vivo-Imager, wenn die Maus narkotisiert ist.
6. Legen Sie eine nosecone über die Nase der Maus und öffnen Sie den Durchfluss auf kontinuierliche Narkosemitteln verwaltensia während der Bildaufnahme (Oxygen Flussraten: 0,5-1 L / min, Isoflurankonzentration: 2-3% (oder weniger).
7. Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec.
8. Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast.

3. Ex vivo Fluoreszenz-Imaging

HerDox Fluoreszenz in Tumoren und bestimmte Organe abgebildet werden (einschließlich der Leber, Niere, Milz, Herz-und Skelettmuskel) von eingeschläfert Mäuse nach 24 Stunden geerntet nach der letzten (Tag 7) Injektion von HerDox.

1. Schalten Sie den Multimode Optical In vivo Imager.
2. Wählen einer Emission Bandpassfilter (580 nm ± 20 nm) für Doxorubicin Fluoreszenzdetektion.
3. Schalten Sie Argon-Krypton-Laser und platzieren Sie eine Anregung Bandpassfilter (488 nm ± 10 nm) bei der Laser-Strahlengang.
4. Platz Tumoren und bestimmten Organen auf einer Petri-Schale in die Kammer o imaging angeordnetf die Multimode Optical In vivo Imager.
5. Erwerben Fluoreszenz-Aufnahmen von Geweben mit einer Belichtungszeit von 5-15 sec. Ein Beispiel für anfängliche Fluoreszenz Bildaufnahme ist in Abbildung 2a dargestellt. Wiederholen Sie das gleiche mit einem leeren Petrischale, die als Hintergrund (Abbildung 2b) dienen wird.
6. Führen Bildanalyse und-verarbeitung einschließlich Hintergrund Korrektur oder Kontrast. Ein Beispiel für eine korrigierte Bild wird in 2c dargestellt, aus der Subtraktion von 2b aus Figur 2a.

4. In situ konfokale Bildgebung von Tumoren

In situ konfokale Abbildung ermöglicht die Erfassung und Analyse von HerDox Tumorakkumulation auf zellulärer Ebene.

1. Schalten Sie eine Leica SPE konfokalen Mikroskop.
2. Wählen Sie 488 nm Laserlicht zur Anregung von Doxorubicin und Emissions-Wellenlängen (560-620 nm) für DoxorubicinFluoreszenzdetektion.
3. Wählen Sie einen 40X oder 63X objektiv und Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv.
4. Auszug frisch Tumoren von Mäusen, die eingeschläfert zuvor empfangenen HerDox und Mock Behandlungen wie in Verfahren ² beschrieben.
5. Platz Tumoren auf einer Petrischale auf Eis zu vermeiden Gewebeabbau und übertragen dann die Tumoren zu einem Delta T Kammer für die konfokale Bildgebung.
6. Erwerben konfokale Bilder der Tumoren bei sequentiellen Fokustiefen (Schrittweite: 1 um, Dicke: 20 um). Ein Beispiel nacheinander aufgenommenen Bildern entlang der z-Achse ist in Fig. 3 linken Seite gezeigt.
7. Führen maximale Intensität z-Projektion der Bilder. Ein Maximum Intensity Projection der z-gestapelten Bilder ist in Fig. 3, rechte Tafel gezeigt.
8. Berechnung der mittleren Fluoreszenzintensitäten der maximalen Intensität Z -. Projektion Bilder Mittlere Fluoreszenzintensitäten der Bilder über das gesamte Sichtfeld wurden berechnetd mit ImageJ.

5. Ratiometric Spectral Imaging and Analysis

Ratiometric spektralen Bildgebung und Analyse ermöglicht Diskriminierung zwischen Dox Fluoreszenz und Autofluoreszenz.

1. Leistung auf einem Laser-Scanning-Fluoreszenz-konfokalen Mikroskop.
2. Erwerben 15 Bilder der HerDox-behandelten und unbehandelten Tumoren in einer bestimmten Tiefe im Spektralbereich von 510-650 nm, mit einer Schrittweite von 10 nm und Anregung bei 488 nm Licht unter Verwendung eines Leica SPE konfokalen Mikroskop.
3. Bereiten Sie eine 100 uM Lösung von Doxorubicin.
4. Führen spektralen Bildgebung des 100 pM Doxorubicin-Lösung, um das reine spektrale Signatur von Dox Fluoreszenz (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt Größe: 10 nm) zu erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 4 dargestellt.
5. Erwerben Sie die Autofluoreszenz spektrale Signatur von einem Bild cube (Spektralbereich: 510-650 nm, ein Schritt: 10 nm) von Spectral Imaging von unbehandelten Tumoren erhalten. Typische Ergebnisse der Bildaufnahme von Spectral Imaging und die daraus resultierende Fluoreszenzspektrum aufgetragen als ein Graph in Abbildung 5 dargestellt.
6. Generieren vier Referenz spektralen Signaturen (reine Autofluoreszenz 0.1.doxorubin +0.9. Autofluoreszenz, 0.2. Doxorubicin +0.8. Autofluoreszenz 0.3.doxorubin +0.7. Autofluoreszenz) mit dem Programm, das wir entwickelt ^9. Eine typische Kurve vier Referenz spektralen Signaturen ist in Abbildung 6 dargestellt.
7. Führen spektrale Klassifizierung der Bilder durch den Verweis spektralen Signaturen durch Euklidische Distanzmaß mit dem Programm, das wir zuvor entwickelten ⁹ definiert.
8. Die lineare Entmischung dieser Bilder durch die Verwendung eines Entmischung Programm (Plug-in in ImageJ) entwickelten wir ^{7, 10,} zum Vergleich mit der ratiometrischen Spectral Imaging und Analyse. Ein example der Trennung HerDox Fluoreszenz von Autofluoreszenz durch lineare Entmischung ist in Abbildung 7 dargestellt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die in vivo optische Scanner-Prototyp, der für die Zwecke der Bildaufnahme unter mehreren Modalitäten, einschließlich Fluoreszenz-Intensität, spektrale, Lebensdauer, 2-Photonen-, intra-vital konfokalen und Biolumineszenz-Bildgebung gebaut wurde. Darüber hinaus liefert die gekühlte hochempfindliche Kamera und Hochleistungslaser Linien in diesem System eingebaut höheren Kontrast Fluoreszenzbilder Vergleich zu kommerziellen optischen Abbildungssystemen ^11, insbe...

Diskussion

Dox Fluoreszenz in vivo nachweisbar sein mit der Multimode-Imager, wenn Tumoren subkutane sind. Allerdings ist die therapeutisch wirksame Dosis von HerDox (0,004 mg / kg) unterhalb der Nachweisgrenze nach einer Einzeldosis. Im Gegensatz dazu, nach 7 tägliche Injektionen (1x/day für 7 Tage), ist der Tumor Akkumulation und Retention der Partikel ausreicht, um die Visualisierung von Dox Fluoreszenz ermöglichen.

Es ist wichtig bei der Arbeit mit Dox oder einem anderen Fluorophor für...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B