Hedefli Viral Protein analizi HER2 + tümörler için teslim Nanopartiküller

Özet

Bu makalede, tümör hedefli nanoparçacık, Herdox optik görüntüleme analizi için prosedürler. Özellikle, hedef ve tümör penetrasyon değerlendirilmesi tümör tespit için çoklu görüntüleme cihazı ayrıntılı kullanımı burada açıklanmıştır.

Özet

HER2 + tümör hedefli bir nanoparçacık, Herdox, HER2 + kanseri olan bir hayvan modelinde tümör tercihli birikimi ve tümör büyümesini ablasyon sergiler. Herdox küçük bir nükleik asit bağlayıcı yoluyla, kemoterapi ajanı, ve doksorubisin, bir tümör hücresi hedefli penetrasyon proteininin kovalent olmayan bir montajı ile oluşur. Elektrofilik, ardalanması ve oligomerizasyonu etkileşimleri bir arada turu 10-20 nm parçacıklar halinde kendinden montaj kolaylaştırır. Herdox farklı sıcaklıklarda kan hem de uzun süreli depolama stabilitesi gösterir. Kalp ve karaciğer (hedefsiz doksorubisin ile işaretlenmiş zarar görür olan) da dahil olmak üzere tümör olmayan doku tespit edilebilir bir yan etkileri, tümör-hücre ölümü, tümör taşıyan farelere sonuçları Herdox sistemik olarak verilmesine. HER2 yükseklik ekspres hücreleri ile karşılaştırıldığında bu nedenle yüksek seviyelerde HER2 gösteren tümörlerin Herdox daha fazla birikimi gösteren, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ifade eden hücrelere hedefleme kolaylaştırırin vitro ve in vivo olarak daha düşük seviyelerde, şarkı. Yerinde konfokal ve spektral analiz ile birlikte floresan görüntüleme bizi hedef in vivo tümör ve sistemik doğumdan sonra Herdox tümör hücre nüfuz doğrulamak için izin verdi. Sistemik doğumdan sonra çok modlu görüntüleme ile hedef tümör değerlendirmek için burada detaylı bizim yöntemleri.

Giriş

Tümör hedefleme kemoterapi teslim tedavinin daha çok tümör olmayan doku dağıtmak daha da istenilen hedefe birikir, çünkü hedefsiz ilaçlara göre daha düşük dozda kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için bir potansiyele sahiptir. Ikinci durum, ilacın etkinliğinin sulandırmak ve böylece daha yüksek dozlarda etkili olmasını gerektirecektir olarak, tümör hedefleme standart olmayan hedefli tedavi üzerinde her iki tedavi ve güvenlik avantajı vardır.

Kendi kendini monte nanopartiküller içine kapsülleme ile, kemoterapi hedefleme ilaç, kimyasal olarak kovalent hedefleme moleküllerine bağlı ilaçların aksine değiştirilmemiş kalmasını sağlar. Bu tür bir bağlantı, uyuşturucu ve hedefleme molekülünün her ikisi de aktivitesini değiştirmek için potansiyele sahiptir; kovalent olmayan bir montaj ilaç kudretini muhafaza edilmesini sağlar.

Daha önce yeni üç bileşenli, kendini monte kompleksi, Herdox, HER2 + tümörlerin hedef göstermiştir In vivo ve kalp ¹ de dahil olmak üzere, normal doku koruyucu iken tümör büyüme ablasyon ortaya çıkarır. Herdox reseptör bağlanma hücre penetrasyon proteini HerPBK10 ve kemoterapötik ajan arasındaki kovalent olmayan etkileşim yoluyla oluşan küçük bir nükleik asit bağlayıcı yoluyla doksorubisin (Dox). Endozomal membran penetrasyonu, adenovirüs-türetilmiş Penton baz kapsid proteini ^4-6 arasında birleşme yoluyla gerçekleştirilir ise HerPBK10, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü (HER) bağlar ve ^2-4 reseptör aracılı endositoz tetikler. Protein üzerindeki pozitif yüklü bir etki nükleik asit DNA-interkalate Dox hedeflenmiş dağılım için nakledilebileceği üzerinden bağlama ^{4, 5,} sağlar. Elektrofilik, ardalanması, ve muhtemelen protein oligomerizasyonu etkileşimleri farklı sıcaklıklarda ¹ kan ve uzun saklama koşulları altında kararlı yuvarlak 10-20 nm parçacıklar halinde kendinden montaj kolaylaştırır. Tercihli HER hedefliyorHER2 yükseldiğinde 2 + tümör hücrelerinin gelişmiş afinite ligandı tarafından kolaylaştırılır.

Daha önceki çalışmalar, tümör olmayan doku üzerinde tümörlerde ve karşılaştırma Herdox verim birikmesidir sistemik olarak verilmesine in vivo ⁷ tümör hücrelerine DOX, ^1, ve penetrasyon hedefsiz için göstermiştir. Biz gözlemledim ki tümör hücre girmesinden sonra Herdox bültenleri Dox, çekirdeği ¹ içine Dox birikimi sağlar. Tümör-birikimi nispeten düşük HER2-ifade tümörleri nispeten daha yüksek HER2 seviyeleri ¹ olanlara göre daha az Herdox biriktikçe, reseptör seviyesi ile uyumlu görünüyor. Dahası, etkin bir şekilde hücre ölümü konsantrasyonu farklı hücre yüzeyi HER2 seviyeleri ¹ ifade eden tümör hücre çizgileri üzerinde HER2 ekran ile ters bir ilişki sergiler. Tümör öldürme 10-kat daha düşük dozda üzerinde gerçekleşir olarak Herdox Tar göre, hedefsiz Dox üzerinde tedavi ve güvenlik avantajı sergilergeted uyuşturucu ve hedefsiz Dox ¹ aksine, kalp (ekokardiyografi ve histolojik leke ile tespit edilir) ya da karaciğer (leke TÜNEL ile tespit edilir) dokusu üzerinde tespit edilebilir bir yan etki üretmektedir. Bir viral kapsid protein kendi türetme rağmen, HerPBK10 terapötik seviyelerde ² saptanabilir immünojenitesi sergiler. Bütün adenovirüs için önceden var olan antikorlar HerPBK10 tanıyabilir Oysa, onlar ² bağlayıcı hücre önlemek mümkün değildir.

Zaman içinde ölçülen tümör hacminin hedeflenen tedavi terapötik etkinliğinin değerlendirilmesinde standart bir yöntemdir ve Herdox terapötik etkinliğini değerlendirmek için istihdam edilmiştir. In vivo ve ex vivo floresan görüntüleme ile bu yaklaşım ilave daha iyi verim ⁷ hedef değerlendirmek için izin verdi. Biz özellikle bu Herdox hiçbir doğrulamak için Dox floresan spektral analizi ile eksize tümörlerin yerinde konfokal görüntüleme entegre vart sadece in vivo tümörlerin biriken ama sitoplazma ve çekirdek ⁷ içine tümör hücreleri ve teslim Dox nüfuz. Spektral analiz ayrıca bize otofloresansı ⁷ Dox floresan ayırt sağladı.

Burada sistemik doğumdan sonra in vivo Herdox değerlendirilmesi için daha ayrıntılı olarak yaklaşımımızı göstermek, ve en önemlisi, değerlendirmek için çok modlu görüntüleme yöntemleri ve analizleri ile hedef.

Protokol

1. In vivo sistemik olarak verilmesine

1. 6-8 haftalık nu / nu fare deri altı açısı taraflı yan ksenograft tümörler için enjeksiyon başına Herdox bir 0.004 mg / kg dozda, 0.2 ml eşit steril tuzlu su ile yeterli Herdox karıştırın.
2. Yavaşça kabarcıklar kaçınarak, 29G iğnesi ile donatılmış bir 3/10 cc şırınga içine insülin Herdox karışımı çizin.
3. 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 3-4 (veya daha düşük) Anestezi bir gazı tahliye sistemi (Oksijen akış oranları ile donatılmış bir indüksiyon odasında kısa izofluran maruz indüklenir.
4. Bir anestezi fare (enjeksiyon başına 0.2 mi) bir kuyruk damarı içine tüm karışımı enjekte edilir. IV enjeksiyonu da ölçülü, anestezisiz fare gerçekleştirilebilir.
5. Günde bir, altı ardışık gün boyunca aynı fare enjeksiyon tekrarlayın.

2. In vivo Floresans Görüntüleme

Tümörlerde Herdox floresan birikimi canBir çok modlu kamera kullanarak enjeksiyon son günü (Günlük 7) ile saptanabilir edilebilir. Aşağıdaki işlemleri özel bir makro-aydınlatma ve algılama sistemi (Şekil 1) ⁸ kullanımını gerektirecektir.

1. In vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu açın.
2. Doksorubisin floresan tespiti için uygun bir emisyon bant geçiren filtre (590 nm ± 30 nm) seçin.
3. Argon-Kripton Lazer açın ve lazer optik yolda bir uyarım bant geçiren filtre (488 nm ± 10 nm) yerleştirin.
4. Anestezi sistemi açın ve daha sonra anestezi odası (Oksijen akış hızı bir fare yerleştirin: 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 3-4 (veya daha düşük) bir gazı tahliye sistemi ile donatılmıştır.
5. Anestezi odasından fare anestezi in vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu mod ve görüntüleme odasına fare aktarın.
6. Fare burun üzerinde bir roket ucu konisi yerleştirin ve sürekli anestezi yönetmek için akış açıkgörüntü alımı sırasında sia (Oksijen akış hızı: 0.5-1 L / dk, izofluran konsantrasyonu:% 2-3 (veya daha düşük).
7. 5-15 sn bir pozlama süresi ile floresan görüntüler elde.
8. Arka plan düzeltme veya kontrast ayarı da dahil olmak üzere görüntü analizi ve işleme gerçekleştirin.

3. Floresan Görüntüleme ex vivo

Herdox floresan tümörler ve belirli organlarda görüntülü olabilir (karaciğer de dahil olmak üzere, böbrek, dalak, kalp ve iskelet kası) Herdox son (Günlük 7) enjeksiyondan sonra 24 saat de ötenazi farelerden alınan hasat.

1. In vivo Optik Görüntüleyici olarak Çoklu açın.
2. Doksorubisin floresan tespiti için bir emisyon bant geçiren filtre (580 nm ± 20 nm) seçin.
3. Argon-Kripton Lazer açın ve lazer optik yolda bir uyarım bant geçiren filtre (488 nm ± 10 nm) yerleştirin.
4. Yeri tümörler ve belirli organları görüntüleme odasına o bir Petri-tabağına düzenlenmişf in vivo Optik Görüntüleyici olarak Multimode.
5. 5-15 sn bir pozlama süresi ile dokuların floresan görüntüler elde. Başlangıç ​​floresans görüntü elde etme için bir örnek, Şekil 2a'da gösterilmiştir. Arka Plan (Şekil 2b) olarak görev yapacak olan, Petri-çanak boş kullanarak aynı tekrarlayın.
6. Arka plan düzeltme veya kontrast ayarı da dahil olmak üzere görüntü analizi ve işleme gerçekleştirin. Düzeltilmiş bir görüntü örneği Şekil 2a, Şekil 2b çıkarılması sonucu, Şekil 2c'de gösterilmektedir.

4. Tümörler yerinde Konfokal Görüntüleme olarak

Yerinde konfokal görüntüleme hücresel düzeyde algılama ve Herdox tümör birikimi analiz sağlar.

1. Leica SPE konfokal mikroskop açın.
2. Doksorubisin için doksorubisin ve emisyon dalga boyları (560-620 nm) uyarma için 488 nm lazer ışığı seçinfloresan algılama.
3. Objektif lens üzerinde 40X veya 63X objektif ve damla immersiyon seçin.
4. Prosedür ^2'de tarif edildiği gibi önceden Herdox ve sahte alınan tedaviler ötenazi farenin taze tümörleri Ayıklama.
5. Buz üzerinde bir Petri-tabak yerleştirin tümörler doku bozulmasını önlemek ve daha sonra konfokal görüntüleme için Delta T odasına tümörler aktarmak için.
6. Sıralı odak derinliği (: 1 mikron, kalınlığı: 20 mikron adım boyutu) de tümörlerin konfokal görüntüler elde. Z ekseni boyunca ardışık olarak-elde edilen görüntü bir örnek Şekil 3, sol panel gösterilmiştir.
7. Maksimum yoğunluk görüntüleri z projeksiyon gerçekleştirin. Z-yığılmış görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyonu Şekil 3, sağ panelde gösterilir.
8. . Maksimum yoğunluğun floresan yoğunlukları Z ortalama hesaplama - görünüm genel alan üzerinde görüntü floresan yoğunlukları ortalama projeksiyon görüntüleri hesaplamak edildid ImageJ kullanarak.

5. Oranlı metrik Spektral Görüntüleme ve Analiz

Oranlı metrik spektral görüntüleme ve analiz Dox floresan ve otofloresans arasında ayrımcılık sağlar.

1. Floresan konfokal mikroskop tarama bir lazer güç.
2. Bir adım 10 nm boyutu ve bir Leica SPE konfokal mikroskop kullanılarak 488 nm ışık uyarma ile, 510-650 nm spektral aralığında belirli bir derinlikte Herdox-tedavi edilen ve edilmeyen tümörler 15 görüntüler elde.
3. Doksorubisin bir 100 mcM çözüm hazırlayın.
4. Dox floresan (: 510-650 nm, bir adım boyutu: 10 nm spektral aralığı) saf spektral imza elde etmek için 100 mcM doksorubisin çözümün spektral görüntüleme gerçekleştirin. Bir grafik Şekil 4'te gösterildiği gibi spektral görüntüleme ve floresan spektrumu çıkan görüntü elde etme tipik sonuçlar çizilmiştir.
5. Bir görüntü c otofloresans spektral imza Edinmeube (spektral aralığı: 510-650 nm, bir adım boyutu: 10 nm) tedavi edilmemiş tümörlerin spektral görüntüleme ile elde edilen. Gösteren bir grafiktir, Şekil 5'te gösterildiği gibi spektral görüntüleme ve floresan spektrumu çıkan görüntü elde etme tipik sonuçlar çizilmiştir.
6. Biz ⁹ geliştirilen programı kullanarak dört referans spektral imzaları (saf otofloresansı, 0.1.doxorubin +0.9. Otofloresansı, 0.2. Doksorubisin +0.8. Otofloresansı, 0.3.doxorubin +0.7. Otofloresans) oluşturun. Dört referans spektral imzaları gösteren tipik bir eğrisi Şekil 6'da gösterilmektedir.
7. Daha önce ⁹ geliştirilen program kullanılarak Öklid uzaklık ölçüsü üzerinden referans spektral imzaları tarafından tanımlanan görüntülerin spektral sınıflandırılması gerçekleştirin.
8. Rasyometrik spektral görüntüleme ve analiz için karşılaştırma için biz ⁷ geliştirilmiş bir spektral Karışmama programı (ImageJ ^{plug-in), 10,} kullanarak bu görüntülerin doğrusal spektral Karışmama gerçekleştirin. Bir elineer spektral Karışmama göre otofloresans ikinci Herdox floresan ayırma xample Şekil 7 'de gösterilmiştir.

Sonuçlar

Şekil 1 floresan, spektral, ömür boyu, 2-foton, içi hayati konfokal ve biyoparlaklık görüntüleme dahil olmak üzere birden fazla yöntemleri altında görüntü elde etme amacıyla, için inşa edilmiştir in vivo optik görüntüleyici prototip, gösterir. Buna ek olarak, bu sistem dahil soğutmalı yüksek duyarlı kamera ve yüksek güçlü lazer çizgileri özellikle doksorubisin floresan in vivo tespiti için ticari optik görüntüleme sistemleri ¹¹ il...

Tartışmalar

Dox floresan tümörler subkutan olduğunda çoklu görüntüleyicisi kullanılarak in vivo olarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, Herdox terapötik olarak etkili doz (0.004 mg / kg) tek bir dozdan sonra aşağıdaki algılama eşiğidir. Buna karşılık, 7 günlük enjeksiyonu (7 gün boyunca 1x/day) sonrasında, parçacığın tümör birikimi ve tutma Dox flöresanının görsellenmesin sağlamak için yeterlidir.

Dox veya temiz tekniği kullanılan in vivo görün...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B