표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 HER2 + 종양에 전달 나노 입자

요약

이 문서 상세 종양 표적 나노 입자, HerDox의 광학 영상 분석을위한 절차에 대해 설명합니다. 특히, 표적 종양 침투를 평가 종양 검출을위한 멀티 이미징 장치에 대한 자세한 사용은 여기에 설명되어 있습니다.

초록

HER2 + 종양 표적 나노 입자, HerDox는 HER2 + 암 동물 모델에서 종양 특혜 축적과 종양 성장 절제를 전시하고 있습니다. HerDox가 작은 핵산 링커를 통해, 화학 요법 제, 독소루비신과 종양 표적 세포 침투 단백질의 비공유 자기 조립에 의해 형성된다. 전자 성, 층간 및 올리고머 상호 작용의 조합은 라운드 10-20 nm의 입자로 자기 조립을 용이하게합니다. HerDox 서로 다른 온도에서 혈액뿐만 아니라, 확장 된 스토리지 안정성을 전시한다. 심장과 간 (타겟이 불분명 한 독소루비신에 의한 표시 손상을 받아야 함) 등의 비 종양 조직에 탐지되지 않는 부작용을 가진 종양 세포 죽음 종양 베어링 마우스 결과에 HerDox의 전신 배달. HER2 고도 세포 발현에 비해 따라서 높은 HER2 수준을 표시하는 종양이 HerDox의 큰 축적을 전시, 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 세포를 표적으로 용이in vitro와 in vivo에서 모두 낮은 수준을 노래. 현장 공 초점 및 스펙트럼 분석과 결합 된 형광 강도 영상은 우리가 대상으로 생체 내 종양 조직 출산 후 HerDox의 종양 세포의 침투에 확인 할 수있다. 조직 배달 후 멀티 영상을 통해 표적 종양을 평가하는 여기에 우리가 세부 사항 우리의 방법을.

서문

종양 표적 항암 화학 요법의 것이 전달되는 치료보다 오히려 비 종양 조직에 배포하는 것보다 의도 한 대상에 축적 할 수 있기 때문에 타겟이 불분명 한 약물에 비해 낮은 복용량에서 암 세포를 제거하는 잠재력을 가지고있다. 후자의 상황이 약물의 효능을 희석하기 때문에 과다 복용 효과가 필요 하듯이, 종양 타겟팅 표준 비 표적 치료를 통해 모두 치료 및 안전 이점이있다.

자기 조립 나노 입자에 캡슐화 화학 요법을 표적으로하는 약물이 화학적으로 공유 결합 대상 분자에 연결되어있는 약물과는 대조적으로 변경되지 않은 상태를 유지할 수 있습니다. 이러한 결합은 약물과 표적 분자 모두의 활동을 변경할 가능성이 있기 때문에, 비공유 어셈블리 약물 효능을 유지 할 수 있습니다.

우리는 이전에 소설은 세 가지 구성 요소, 자기 조립 복잡한 HerDox는 HER2 + 종양을 대상으로하는 것으로 나타났습니다 생체 및 심장 ¹ 등, 정상 조직을 살려주는 동안 종양의 성장 절제를 이끌어. HerDox이 수용체 결합 세포 침투 단백질, HerPBK10 및 화학 요법 에이전트 사이의 비공유 상호 작용을 통해 형성되고, 작은 핵산 링커를 통해 독소루비신 (독스). endosomal 막 침투가 아데노 바이러스 파생 penton 기본 캡시드 단백질 ^4-6의 결합을 통해 수행되는 동안 HerPBK10는, 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER) 바인딩 ^2-4 수용체 매개 세포 내 이입을 트리거합니다. 단백질의 양전하 도메인 핵산에게 DNA-협재 독스가 타겟 배달을 위해 운송 할 수있는을 통해 바인딩 ^{4, 5를} 할 수 있습니다. 전자 성, 윤달, 그리고 아마도 단백질 올리고머의 상호 작용은 서로 다른 온도 ^1에 혈액 및 확장 보관하는 안정 라운드 10-20 nm의 입자로 자기 조립을 용이하게합니다. 우선 그녀에게 대상HER2가 상승 할 때 2 + 종양 세포는 강화 된 리간드 친화력에 의해 촉진된다.

우리의 이전 연구는 비 종양 조직에 종양과 비교 HerDox 금리 우대 체계적 축적 배달 생체 내 ^7에있는 종양 세포에 독스 ¹ 및 침투 불분명하는 것으로 나타났습니다. 우리가 관찰 한 종양 세포 기입 한 후 HerDox 릴리스는 독스, 핵 ^1에 독스 축적을 허용. 종양의 축적은 상대적으로 낮은 HER2 발현 종양이 비교적 높은 HER2 레벨 ^1에 비해 적은 HerDox 축적으로, 수용체 수준과 상관 관계가 나타납니다. 또한, 효과적인 세포 사멸 농도는 다른 세포 표면에게 HER2 레벨 ^1을 표현하는 종양 세포 라인에서 HER2 디스플레이와 역 상관 관계를 나타낸다. 종양 살해 10 배 낮은 복용량 이상에서 발생으로 HerDox의 압축을 풉니에 비해 불분명 독스를 통해 치료 및 안전 이점을 전시geted 약물과 타겟이 불분명 독스 ¹ 대조적으로, 심장 (심장 초음파 검사 및 조직 학적 염색에서 감지) 또는 간 (얼룩 TUNEL에 의해 감지) 조직에는 감지 악영향을 얻을 수 없습니다. 바이러스 캡시드 단백질로부터 유도에도 불구하고, HerPBK10는 치료 ^수준이 전혀 검출 면역 원성을 전시하지 않습니다. 전체 아데노 바이러스에 기존의 항체가 HerPBK10을 인식 할 수있는 반면, 그들은 ² 바인딩 셀을 방지 할 수 없습니다.

시간이 지남에 따라 측정 된 종양의 부피는 표적 치료제의 치료 효과를 평가하는 표준 방법이며, HerDox의 치료 효능을 평가하기 위해 고용되었다. 생체 내 및 생체 형광 강도 이미징에이 방법을 보완하면 더 나은 효율성 ^7을 대상으로 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 특히 그 HerDox 전혀 확인하지 않도록 Dox가 형광 스펙트럼 분석을 절제 종양의 현장 공 촛점 이미징 통합했습니다T는 생체 내 종양에 축적하지만, 세포질 및 핵 ^7에 종양 세포와 전달 독스에 침투. 스펙트럼 분석은 또한 우리가자가 형광 ^7에서 독스 형광을 구별 할 수있었습니다.

여기에서 우리는 조직 배달 후 생체 내에서 HerDox을 평가 자세하게 우리의 접근 방식을 보여, 그리고 가장 중요한, 평가하기위한 멀티 이미징 방법과 분석을 통해 대상.

프로토콜

1. 생체 조직 배달

1. 6-8 주 이전 NU / NU 마우스 베어링 피하 양측 측면 이종 이식 종양에 대한 주입 당 HerDox의 0.004 ㎎ / ㎏ 용량의 0.2 ML를 동일시하는 멸균 식염수로 충분히 HerDox 섞는다.
2. 부드럽게 거품을 피하고, 29G 바늘로 장착 3 / 10 cc의 인슐린 주사기에 HerDox 혼합물을 그립니다.
3. 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 3~4% (또는 이하) 마취 가스 청소 시스템 (산소 유량을 갖춘 유도 챔버에 짧은 isoflurane을 노출에 의해 유도된다.
4. 마취 마우스 (주입 당 0.2 ML)의 꼬리 정맥에 전체 혼합물을 주입한다. IV 주입은 또한 제지, unanesthetized 마우스를 수행 할 수 있습니다.
5. 하루에 한 번, 여섯 개의 연속 일 같은 마우스 주사를 반복합니다.

2. 생체 내 형광 이미징

종양 HerDox 형광의 축적 할 수멀티 영상을 사용하여 주입의 마지막 날 (7 일)에 의해 탐지 가능한 수. 아래 절차에서는 사용자 정의 매크로 조명 및 탐지 시스템 (그림 1) ^8의 사용을 수반.

1. 생체 광학 영상에서 다중 모드를 켭니다.
2. doxorubicin의 형광 검출에 적합 방출 대역 통과 필터 (590 nm의 ± 30 nm의)를 선택합니다.
3. 아르곤 - 크립톤 레이저를 켜고 레이저 광 경로에 여기 대역 통과 필터 (488 nm의 ± 10 nm의)를 배치합니다.
4. 마취 시스템을 켠 후 마취 챔버 (산소 유량에 마우스를 올려 : 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 3-4% (또는 이하) 가스 청소 시스템을 갖추고 있습니다.
5. 마취 챔버에서 마우스를 마취입니다 생체 광학 영상에서 다중의 이미징 챔버에 마우스를 전송합니다.
6. 마우스의 코를 통해 노즈콘를 배치하고 지속적인 마취를 관리하는 흐름을 엽니 다영상 획득시 SIA (산소 유량 : 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 2~3% (또는 이하).
7. 15 초 노출 시간을 사용하여 형광 이미지를 획득.
8. 배경 정정 또는 대비 조정 등의 이미지 분석 및 처리를 수행합니다.

3. 형광 이미징 생체

HerDox 형광 종양 특정 기관에 군데 할 수 있습니다 (간을 포함, 신장, 비장, 심장과 골격 근육) HerDox의 마지막 (7 일) 주사 후 24 시간에서 안락사 생쥐에서 수확.

1. 생체 광학 영상에서 다중 모드를 켭니다.
2. 독소루비신 형광 검출을위한 방출 대역 통과 필터 (580 nm의 ± 20 nm의)를 선택합니다.
3. 아르곤 - 크립톤 레이저를 켜고 레이저 광 경로에 여기 대역 통과 필터 (488 nm의 ± 10 nm의)를 배치합니다.
4. 장소 종양과 특정 장기 이미징 챔버 오에 페트리 접시에 배치F 생체 광학 영상에서 다중.
5. 15 초 노출 시간을 사용하여 조직의 형광 이미지를 획득. 초기 형광 이미지 획득의 예는 그림 2a에 표시됩니다. 배경 (그림 2B)로 제공되는, 페트리 접시 빈을 사용하여 동일한 작업을 반복합니다.
6. 배경 정정 또는 대비 조정 등의 이미지 분석 및 처리를 수행합니다. 수정 된 이미지의 예는 그림 2a에서 그림 2B의 뺄셈의 결과, 그림 2C에 표시됩니다.

4. 종양의 현장 공 촛점 이미징

현장 공 촛점 이미징 세포 수준에서 탐지 및 HerDox 종양 축적 분석 할 수 있습니다.

1. 라이카 SPE 공 촛점 현미경을 켭니다.
2. 독소루비신에 대한 독소루비신 및 배출 파장 (560-620 nm의)에 여기에 대한 488 nm의 레이저 광을 선택형광 검출.
3. 대물 렌즈 40X 또는 63X 목적 및 드롭 침수 오일을 선택합니다.
4. 절차 ^2에서 설명한대로 이전 HerDox 및 모의 치료를받은 안락사 생쥐에서 신선한 종양을 추출합니다.
5. 얼음에 페트리 접시에 장소 종양 조직의 저하를 방지하고 공 촛점 이미징을위한 델타 T 챔버에 종양을 전송합니다.
6. 연속 초점 깊이 (: 1 ㎛, 두께 : 20 μm의 스텝 크기)에서 종양의 공 촛점 이미지를 획득. Z-축을 따라 순차적으로 획득 한 이미지의 예는 그림 3의 왼쪽 패널에 표시됩니다.
7. 최대 강도 이미지의 Z - 프로젝션을 수행합니다. Z-스택 이미지의 최대 강도 투사는 그림 3, 오른쪽 패널에 표시됩니다.
8. . 최대 강도의 형광 강도 Z 의미 계산 -보기의 전체 필드에 이미지의 형광 강도를 평균 투사 이미지는 계산 하였다D ImageJ에 사용.

5. 비례 스펙트럼 이미징 및 분석

비례 스펙트럼 이미징 및 분석 독스 형광자가 형광 사이의 차별을 할 수 있습니다.

1. 형광 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저의 전원을 켭니다.
2. 단계 10 나노 미터의 크기, 라이카 SPE 공 촛점 현미경을 사용하여 488 nm의 빛을 여기에, 510-650 ㎚의 스펙트럼 범위 내에서 지정된 깊이에서 HerDox 처리 및 치료 종양의 15 이미지를 획득.
3. 독소루비신의 100 μM 솔루션을 준비합니다.
4. 독스 형광 (: 510-650 nm의 스텝 크기 : 10 nm의 스펙트럼 범위)의 순수한 스펙트럼 서명을 얻기 위해 100 μM의 독소루비신 솔루션의 스펙트럼 이미징을 수행합니다. 그래프가 그림 4에 표시된대로 분광 이미징 및 형광 스펙트럼 결과에서 이미지 수집의 전형적인 결과를 꾸몄다.
5. 이미지 C에서자가 형광 스펙트럼 서명을 취득우베 (스펙트럼 범위 : 510-650 nm의 스텝 크기 : 10 nm의) 치료 종양의 스펙트럼 영상으로 얻었다. 그래프가 그림 5에 표시된대로 분광 이미징 및 형광 스펙트럼 결과에서 이미지 수집의 전형적인 결과를 꾸몄다.
6. 우리는 ⁹ 개발 프로그램을 사용하여 4 개의 기준 스펙트럼 서명 (순수자가 형광, 0.1.doxorubin +0.9.자가 형광, 0.2. 독소루비신 +0.8.자가 형광, 0.3.doxorubin +0.7.자가 형광) 생성합니다. 4 개의 기준 스펙트럼 특성을 보여주는 전형적인 곡선은 그림 6에 나와 있습니다.
7. 우리가 이전 ⁹ 개발 한 프로그램을 사용하여 유클리드 거리 측정을 통해 참조 스펙트럼 서명에 의해 정의 된 이미지의 스펙트럼 분류를 수행합니다.
8. 비례 스펙트럼 이미징 및 분석 비교를 위해 우리가 ^7을 개발 스펙트럼 unmixing 프로그램 (ImageJ에 플러그 - ^{인), 10를} 사용하여 해당 이미지의 선형 스펙트럼 unmixing을 수행합니다. 전자선형 스펙트럼 unmixing하여자가 형광에서 HerDox 형광을 분리 xample는 그림 7에 나와 있습니다.

결과

그림 1은 형광 강도, 스펙트럼, 수명 2 - 광자, 내 생명 공 초점 및 생물 발광 영상 등 여러 양식에 따라 이미지 수집의 목적을 위해 만들어진 생체 광학 영상 프로토 타입에서 보여줍니다. 또한,이 시스템에 통합 냉각 고감도 카메라와 고성능 레이저 라인은 특히 독소루비신 형광의 생체 검출을위한 상용 광학 이미징 시스템 ^11에 비해 높은 반면 형광 이미지...

토론

DOX 형광 종양이 피하 때 멀티 영상을 이용하여 생체 내에서 탐지 가능한 할 수 있습니다. 그러나 HerDox의 치료 적 용량 (0.004 ㎎ / ㎏)의 단일 복용 후 아래의 감지 임계 값입니다. 반면, 7 매일 주사 (7 일 1x/day) 후, 입자의 종양의 축적과 보존 Dox가 형광의 시각화를 가능하게하기에 충분합니다.

독스 또는 클린 기술이 사용되는 생체 내 이미징을위한 다른 형광 물질?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B