分析有针对性的病毒蛋白的纳米粒子递送HER2 +肿瘤

摘要

本文详细介绍了肿瘤靶向纳米粒子，HerDox光学成像分析的程序。特别是，使用多模成像装置，用于检测肿瘤靶向和评估肿瘤渗透详细描述在这里。

摘要

HER2 +肿瘤靶向纳米粒子，HerDox，具有肿瘤优惠的积累和消融治疗HER2 +癌症动物模型中肿瘤生长。 HerDox形成通过非共价的肿瘤靶向与化疗剂，多柔比星的细胞渗透蛋白的自组装体，通过一个小的核酸连接器。电，插层，齐聚相互作用的结合，促进成圆形的10-20纳米粒子自组装。 HerDox显示出在不同温度下的血中稳定性，以及在扩展存储。全身给药HerDox在荷瘤小鼠的肿瘤细胞死亡的结果没有检测到不利影响的非肿瘤组织，包括心脏和肝脏（发生明显损坏由无目标的多柔比星）。 HER2海拔细胞中的表达相比，有利于靶向表达人表皮生长因子受体的细胞，因此，显示升高的HER2水平的肿瘤表现出较大的积累HerDox唱较低的水平，无论是在体外和体内 。 原位共焦和频谱分析相结合的荧光强度成像已经让我们在体内肿瘤靶向肿瘤细胞渗透全身给药后HerDox的验证。在这里，我们详细介绍我们的方法，以评估肿瘤靶向全身给药后通过多模成像。

引言

肿瘤靶向化疗有可能消除癌细胞不相关的药物相比，在​​较低的剂量，因为可以在其预定的目的地，而不是分发非肿瘤组织蓄积的交付治疗。作为后一种情况下，会稀释药的药效，因此需要较高的剂量是有效的，肿瘤靶向治疗和安全性优于标准的非针对性的治疗。

通过封装在自组装纳米颗粒靶向化疗使药物保持化学改性的共价连接到靶向分子的药物相比。因此联动有可能改变的活性的药物，靶向分子非共价键的组件允许保留药物效力。

我们先前的研究显示，这种新型三分量，复杂的自组装，HerDox，针对HER2 +肿瘤1。通过受体结合的细胞渗透蛋白，HerPBK10，与化疗剂之间的非共价相互作用，形成HerDox，多柔比星（阿霉素），通过一个小的核酸连接器。 HerPBK10结合人类表皮生长因子受体（HER）和，触发受体介导的内吞作用^2-4，而核内体膜的渗透是通过腺病毒衍生的聚氯基地衣壳蛋白^4-6成立。甲带正电荷的蛋白质域使核酸结合^4，5，通过该DNA插霉素可以用于靶向递送运。亲电，插层，并有可能蛋白低聚相互作用促进自组装成圆形10-20nm的颗粒是稳定的血液和根据扩展存储在不同温度下^1。她的优先目标2 +肿瘤细胞是促进增强配体的亲和力，时HER2升高。

我们以前的研究已经表明，在对非肿瘤组织中的肿瘤相比，优惠HerDox产量积累全身给药不相关的Dox诱导^1，渗透进入肿瘤细胞在体内 ^7。我们已经观察到HerDox释放Dox诱导肿瘤细胞的条目后，允许进入细胞核^1的阿霉素积累。肿瘤积累与受体水平相对较低HER2表达肿瘤积累减HerDox相比相对较高的HER2水平^1。此外，有效的细胞死亡的浓度呈现负相关与HER2显示肿瘤细胞株表达不同的细胞表面HER2水平。 HerDox具有不相关的DOX治疗和安全的优势，作为肿瘤杀伤作用发生在超过10倍，低剂量相比解压geted药物和产生心（通过超声心动图和组织学染色检测）或肝功能（TUNEL检测染色）组织上没有检测的不利影响，相反，没有针对性霉素^1。尽管其从病毒衣壳蛋白的推导，HerPBK10展品没有检测免疫原性治疗水平^2。鉴于整个腺病毒的预先存在的抗体可以识别HerPBK10，他们是无法防止细胞结合^2。

测量肿瘤体积随着时间的推移是一个标准的方法，靶向治疗的疗效评估，并已为评估疗效HerDox的雇用。补充这种方法在体内和体外荧光强度成像已经让我们更好地评估靶向效率^7。我们已经专门集成在切除肿瘤的原位共焦成像光谱的DOX荧光分析来验证HerDox只有积累在体内的肿瘤，但渗透到肿瘤细胞和交付阿霉素进入细胞质和细胞核^7。此外，频谱分析使我们能够区分霉素荧光自发荧光^7。

这里，我们证明我们的方法更详细地用于全身给药后在体内的评估HerDox的，最重要的是，通过多模成像方法和分析评估目标。

研究方案

1。全身交付体内的

1. 用无菌生理盐水足够HerDox的混合等同于0.2毫升0.004毫克/千克的剂量注射HerDox每6-8周的老NU / NU鼠标轴承皮下双边侧翼异种移植肿瘤。
2. 轻轻绘制HerDox的混合物倒入一个3/10毫升配备29G针头的胰岛素注射器，避免气泡。
3. 进行了简短的异氟醚麻醉诱导感应室配备一个气体净化系统（氧气流速：0.5-1升/分钟，异氟醚浓度：3-4％（或更低）。
4. 整个混合物注入到麻醉小鼠的尾静脉中（0.2毫升，每次注射）。内敛的，非麻醉鼠标也可以进行静脉注射。
5. 六年多的连续天重复注射相同的鼠标，每天一次。

2。 在体内荧光成像

积累的HerDox荧光肿瘤注射的最后一天（7天）使用多模成像仪可以探测到。下面的过程中需要使用自定义的宏照明和探测系统（ 图^1）8。

1. 打开模体内光学成像仪 。
2. 选择适合阿霉素荧光检测发射带通滤波器（590纳米±30纳米）。
3. 打开氩气，氪激光，在激光的光路中放置一个激励的带通滤波器（488纳米±10nm的）。
4. 打开麻醉系统上，然后放置到麻醉箱（氧气流速：0.5〜1升/分钟，异氟醚的浓度为3-4％（或更低）的气体清除系统配备鼠标。
5. 将鼠标成像室在模体内光学成像仪 ，当鼠标麻醉麻醉室。
6. 将鼠标的鼻子，打开一个头锥流管理持续麻醉医师SIA在图像采集（氧气流速：0.5-1升/分钟，异氟醚浓度2-3％（或更低）。
7. 获取荧光图像的曝光时间为5-15秒。
8. 执行背景校正或对比度调整的图像分析和处理。

3。 体外荧光成像

可以HerDox荧光成像在肿瘤和特定的器官（包括肝，肾，脾，心，骨骼肌）收获安乐死的小鼠在24小时后，最终（7天）注射HerDox。

1. 打开模体内光学成像仪 。
2. 选择阿霉素荧光检测发射带通滤波器（580纳米±20 nm的）。
3. 打开氩气，氪激光，在激光的光路中放置一个激励的带通滤波器（488纳米±10nm的）。
4. 到成像室Ø安排在一个培养皿将肿瘤和特定器官f为模体内光学成像仪。
5. 采集的组织中使用的曝光时间为5-15秒的荧光图像。初始荧光图像采集的一个例子示出在图2a中。重复使用空培养皿，这将作为背景（ 图2b）。
6. 执行背景校正或对比度调整的图像分析和处理。纠正后的图像的一个例子是如图2c所示，产生从图2a，图2b减法。

4， 在肿瘤的原位共聚焦成像

在原位共焦成像允许的HerDox肿瘤积累在细胞水平上的检测和分析。

1. 打开一个徕卡SPE共聚焦显微镜。
2. 选择488 nm激光激发阿霉素，阿霉素和发射波长（560-620纳米）的光荧光检测。
3. 选择一个目标和滴浸油物镜40X或63X。
4. 提取新鲜从先前接收HerDox和模拟处理步骤²中描述的安乐死小鼠的肿瘤。
5. 在培养皿上冰，以避免将肿瘤组织退化，然后肿瘤转移到三角洲T室共聚焦成像。
6. 采集的肿瘤的共聚焦图像，按顺序震源深度（步长：1微米，厚度：20微米）。沿z轴的顺序获得的图像的一个例子示出在图3中，左侧面板中 。
7. 进行最大强度z轴投影的图像。 Z-叠图像的最大强度投影显示在图3中，右面板 。
8. 在整个视场的图像的平均荧光强度，计算出平均荧光强度的最大强度Z - 投影图像。计算D使用ImageJ的。

5。比率光谱成像与分析

比率光谱成像和分析，可以区分霉素荧光和自发荧光。

1. 激光扫描荧光共聚焦显微镜上的电源。
2. 采集15幅图像的HerDox处理和未经处理的肿瘤为510-650纳米的光谱范围内，在指定的深度，步长为10nm时，激发波长为488纳米的光，使用Leica SPE的激光共聚焦显微镜。
3. 准备100微米的解决方案的阿霉素。
4. 执行的100μM阿霉素溶液的光谱成像获得纯光谱特征的Dox诱导荧光（波长范围510-650纳米，步长大小：10纳米）。从光谱成像和由此产生的荧光光谱图像采集的典型结果绘制的曲线图如图4所示。
5. 采集自体荧光光谱特征，从图像CUBE（光谱范围：510-650 nm的步长：10纳米）光谱成像未经处理的肿瘤。从光谱成像和由此产生的荧光光谱图像采集的典型结果绘制的曲线图如图5所示。
6. 产生四个的参考光谱特征（纯自发荧光，+0.9 0.1.doxorubin。自发荧光，0.2 +0.8阿霉素自体荧光，+0.7 0.3.doxorubin。自发荧光）使用该程序，我们制定了^9。在图6中示出一个典型的曲线示出四个基准光谱签名。
7. 执行光谱图像的分类所定义的参考通过使用该程序，我们以前开发的⁹欧氏距离测度的光谱特征。
8. 这些图像进行线性光谱分离，通过使用光谱分离程序（插件在ImageJ），我们开发了^7，10，比例光谱成像和分析比较。一封图7中所示的xample分离荧光HerDox的线性光谱分离的自体荧光。

结果

图1显示了在体内光学成像样机下图像采集多种方式，包括荧光强度，光谱，寿命，双光子，重要的内焦，生物发光成像的目的，这是建。此外，冷却的高灵敏度的摄像头和纳入在本系统中的高功率激光线会产生更高的对比度比商业光学成像系统^11的荧光图像，特别是用于检测体内阿霉素荧光。因此，该系统是用于在本研究中，获得多个互补的数据点在体内

讨论

阿霉素荧光可以检测到体内时使用多模成像肿瘤皮下。然而，治疗有效剂量的HerDox（0.004毫克/千克）的检测阈值以下后，单次剂量。相比之下，经过7每天注射（7天1x/day），，肿瘤的积累和保留的粒子是足以使阿霉素荧光可视化。

这是至关重要的工作时，与阿霉素在体内成像，使用清洁技术或任何其他荧光。鼠标的外侧上的滴水应避免，因为成像器将检测到皮肤...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence laser scanning confocal microscope	Leica	SPE
In Vivo Optical Imager	Spectral Molecular Imaging	Multimode In Vivo Optical Imager
Doxorubicin-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week	Charles River	Strain code 088
MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells	NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository	0507292
3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle	BD	309301
Delta T chamber	Bioptechs	04200417B