فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Summary

توضح هذه المقالة استخدام luciferase يراعة-GFP انصهار بروتين للتحقيق في الجسم الحي طي البروتين في خميرة الخباز. باستخدام هذا الكاشف، طوي ثانية من نموذج البروتين للحرارة التشويه والتحريف يمكن رصدها في وقت واحد بواسطة المجهر مضان وفحص الأنزيمية للتحقيق في أدوار مكونات شبكة proteostasis في مراقبة الجودة البروتين.

Abstract

Proteostasis، الذي يعرف بأنه العمليات مجتمعة من البروتين للطي / النشوء الأحيائي، طوي ثانية / إصلاح، وتدهور، هو توازن دقيق الخلوية التي يجب المحافظة عليها لتجنب العواقب الوخيمة ^1. العوامل الخارجية أو الداخلية التي تعطل هذا التوازن يمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتين، والسمية وموت الخلايا. في البشر هذا هو أحد العوامل الرئيسية التي تسهم في الأعراض المصاحبة للاضطرابات العصبية مثل هنتنغتون، باركنسون، والأمراض الزهايمر ^10. ولذا فمن الضروري أن البروتينات المشاركة في صيانة proteostasis أن يتم تحديدها من أجل تطوير علاجات لهذه الأمراض المنهكة. توضح هذه المقالة التقنيات للرصد في طي البروتين في الجسم الحي في القرار قرب الوقت الحقيقي باستخدام نموذج البروتين luciferase يراعة تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP FFL-). FFL-GFP هو نموذج البروتين خيالية فريدة من نوعها كما شاردة FFL هو حساسة للغاية التوتر الناجم عن مisfolding والتجميع، الذي يثبط نشاط الإنزيم ^12. ويتم رصد luciferase النشاط باستخدام مقايسة الأنزيمية، ويوفر شاردة GFP وسيلة لتصور FFL قابل للذوبان أو مجمعة باستخدام المجهر الآلي. هذه الأساليب إلى جانب إدراج نهجين متوازيين ومستقلين من الناحية الفنية لتحليل كل من طوي ثانية وإعادة تنشيط الوظيفية للانزيم بعد الإجهاد. انتعاش النشاط يمكن ربط مباشرة مع حركية التفكيك وإعادة الانحلالية إلى فهم أفضل لكيفية العوامل مراقبة الجودة بروتين مثل البروتين المحرمين التعاون من أجل أداء هذه المهام. وبالإضافة إلى ذلك، الحذف أو طفرات الجينات يمكن استخدامها لاختبار المساهمات بروتينات معينة أو الوحدات الصغرى البروتين لهذه العملية. في هذه المقالة ندرس المساهمات من البروتين disaggregase Hsp104 ^13، والمعروف أن شريك مع عامل تبادل Hsp40/70/nucleotide (NEF) طوي ثانية نظام ^5، طوي ثانية إلى البروتين للتحقق من صحة هذا النهج.

Introduction

في البشر وقد تم ربط الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر، وباركنسون، والأمراض هنتنغتون إلى misfolding البروتين والتجميع ^10. الخلايا توظيف المحرمين الجزيئية لمنع محاصرة الحركية من البروتينات الخلوية في الهياكل غير نشط تتجمع ^6. المشاركة المحرمين في شبكات تفاعل معقدة داخل الخلية، ولكن ليست مفهومة تماما كيف أن مجموع هذه التفاعلات يساهم في proteostasis العضوي. واحد من المحرمين الرئيسية المسؤولة عن غالبية عصاري خلوي للطي البروتين هو بروتين الصدمة الحرارية دينار كويتي 70 (HSP70) الأسرة ^19. وقد تبين أنه في فقدان الخميرة النقص HSP70 القدرة على أضعاف الوليدة FFL أعرب heterologously وrefold البروتين الذاتية، الأورنيثين ناقلة الكربامويل، في الجسم الحي ^{18، 7.} والقدرة على تحليل للطي مع القرار في الوقت شبه الحقيقي تيسير فهم كيف إضافية العوامل الخلوية تابعribute لهذه العملية التي تعتمد على HSP70. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون قابلة للطي / طوي ثانية التفاعلات تعتمد اعتمادا كليا على هذه البروتينات المساهمة، لذلك يجب أن تكون المقايسات حساسة بما يكفي للكشف عن كلا من التغيرات الكبيرة والصغيرة في حركية وكفاءة.

وdisaggregase خلية الخميرة، Hsp104، تلعب دورا حيويا في إصلاح البروتينات تتجمع المجمعة. على الرغم من أن تم التعرف Hsp104 homologs في الفطريات والنباتات، وهذه العائلة ويبدو أن تغيب في metazoans. وقد اقترح أن المحرمين أخرى مثل تلك الأسرة Hsp110 أداء بعض الأنشطة المعروفة Hsp104 في الثدييات ^16. Hsp104 هو AAA +، بروتين معقد hexameric الذي يعمل في الخميرة إلى المجاميع البروتين اعادة تشكيلها، والمساهمة في طوي ثانية وإصلاح ^13. Hsp104، جنبا إلى جنب مع الخميرة HSP70، SSA1، والخميرة Hsp40، Ydj1، مطلوب للتعافي من FFL التشويه والتحريف في خلايا الخميرة ^{5 و 8.} وقد تبين أن الحرارة الصغيرة بروتين الصدمة، Hsp26، أيضا أن يكون ل requiأحمر لتفصيل Hsp104 بوساطة من FFL ^2.

FFL هو بروتين ثنائي المجال الذي يربط الركيزة luciferin في موقع نشط وبعد تغيير متعلق بتكوين الذي يتطلب ATP والأكسجين، decarboxylates الركيزة الإفراج oxyluciferin، وثاني أكسيد الكربون (CO _2)، أحادي فسفات الأدينوزين (AMP)، وضوء ^{11، 9، 3.} الركيزة المتاحة تجاريا FFL، D-وسيفيرين، والنتائج في انبعاث الضوء بين 550-570 نانومتر التي يمكن أن يتم الكشف عن باستخدام luminometer ^15. FFL حساس بشكل رائع لتمسخ من العلاجات الكيميائية أو الحرارة والمجاميع بسرعة على تتكشف. عندما تتعرض لدرجات حرارة تتراوح بين 39-45 درجة مئوية وتكشفت FFL عكسية والمعطل ^12. في المقابل، GFP ومشتقاته هي مقاومة للبروتين تتكشف الضغوط ¹⁴ للغاية. فيوجين من هذه البروتينات اثنين يسمح FFL ليعمل وشاردة عطوب تجريبيا قادرة على استهداف وظيفية GFP بين الخلايا الودائع التي يمكن تصور باستخدام المجهر مضان في كل من السكان ومستويات خلية واحدة. تطبيق فحص الأنزيمية في قارئ لوحة المتعدد شبه الآلي إلى جانب المجهر الآلي يسمح التقييم في وقت واحد لم يسبق له مثيل من حركية والعائد من ردود الفعل طوي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، علم الوراثة الجزيئي السطحية للنموذج حقيقي النواة خميرة الخباز يسمح على حد سواء التلاعب الدقيق للشبكة مراقبة جودة البروتين وإتاحة الفرصة للنهج القائم على الاكتشاف لتحديد اللاعبين رواية المساهمة في الاستجابة للضغط النفسي الخلوية وproteostasis.

في هذه الدراسة، البرية من نوع (WT) وHSP104 الحذف سلالات معربا عن FFL-GFP تخضع لتغيير طبيعة بروتين الصدمة الحرارية. ويتم رصد FFL-GFP طوي ثانية من خلال كل من فحص الأنزيمية والفحص المجهري وقراءات وكيل لإصلاح بروتيوم أعرب أكثر من مرة بالطبع الانتعاش. بالمقارنة مع خلايا WT، وتبين لنا اله Hsp104 سلالة الحذف هو ~ 60٪ أقل كفاءة في طوي ثانية FFL-GFP، ودعم النتائج السابقة إنشاء دور للHsp104 في تنشيط التشويه والتحريف FFL ^2.

Protocol

1. بناء سلالات تحتوي على FFL-GFP البلازميد

لهذه الدراسة، خميرة الخباز سلالة BY4741 (MAT لذلك، his3Δ1، leu2Δ0، met15Δ0، ura3Δ0) كانت تستخدم جنبا إلى جنب مع سلالة الحذف HSP104 من جمع خروج المغلوب الخميرة (فتح النظم البيولوجية / الحرارية العلمية). تم تأكيد الحذف باستخدام الأجسام المضادة Hsp104 محددة للتحليل لطخة غربية.

وأعرب عن FFL-GFP من p426MET25-FFL-GFP، التي شيدت من مصدر المستندة إلى LEU2 البلازميد التي تم الحصول عليها من المختبر غلوفر في جامعة تورونتو ¹⁷ والتي يمكن الحصول عليها عند الطلب للمؤلفين. يتم التحكم تعبير عن انصهار بروتين GFP البلازميد FFL-من قبل MET25 مروج ميثيونين-كظوم. تحولت البلازميد في كل سلالة باستخدام بروتوكول تم تكييفها من GIETZ وآخرون. آل، 1995:

1. أجهزة الطرد المركزي 25 مل س و الخلايا مرحلة دخول في أنبوب مخروطي 50 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، ويغسل مع 500 ميكرولتر من ضعف المقطر H ₂ 0 ([ده ₂ O)، وتجاهل الطافي.
2. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من TE / LiAc (تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 ملم، ودرجة الحموضة = 7.5، 1 ملم EDTA، 0.1 M خلات الليثيوم). احتضان عند 30 درجة مئوية دون خلط لمدة 20 دقيقة.
3. نقل 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى أنبوب جديد جنبا إلى جنب مع 5 مل (50 ميكروغرام) من الحمض النووي الناقل و5 ميكرولتر (0،1-5 ميكروغرام) من الحمض النووي البلازميد. إضافة 300 ميكرولتر من PEG / TE / LiAc (نفس TE / LiAc بالإضافة إلى 40٪ البولي ايثيلين جلايكول) إلى هذا الخليط، والخلايا احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
4. إضافة حجم 1/10 (V / V) DMSO (36 ميكرولتر) إلى هذا الخليط والصدمة الحرارية في 42 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
5. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وإزالة الطافي. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العقيمة DDH ₂ 0 والخلايا لوحة على وسائل الإعلام كاملة الاصطناعية تفتقر اليوراسيل (SC-URA).

2. تحريض FFL-GFP

NT "هو فعل> FFL-GFP الخلايا مرة واحدة في مرحلة السجل بحيث يتم الغالبية العظمى من البروتين قبل للصدمة الحرارة حديثا لتجنب البروتينات التي تم تجميع عناصره من شفائهم مع مرور الوقت بسبب القصور الخلوية الشيخوخة المرتبطة.

1. يوم 1: الخلايا احتضان في 5 مل من SC-URA في 30 ° C الدورية O / N.
2. يوم 2: قياس OD ₆₀₀ والثقافات الطازجة تلقيح في 5 مل من SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0.2.
3. احتضان الثقافات مع دوران عند 30 درجة مئوية حتى بلوغهم مرحلة دخول OD ₆₀₀ ~ 0.8-1.0.
4. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، صب الطافي و resuspend الخلية بيليه في 500 ميكرولتر من DDH ₂ 0؛ حل نقل إلى أنبوب microcentrifuge.
5. الطرد المركزي في 6،000 دورة في الدقيقة وتجاهل الطافي.
6. Resuspend الخلايا في 5 مل من SC-URA-MET. وينبغي حضنت الخلايا الدورية في هذه الوسائط لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية.
7. خلايا الطرد المركزي وتكرار غسل في DDH ₂ 0 وتجاهل الطافي.
8. Resuspeالخلايا الثانية في 5 مل سائل الإعلام SC-URA تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد لكبح بروتين تعبير، والشروع فورا في الخطوة 3.

3. الأنزيمية FFL-GFP استعادة الفحص

هذا الاختبار هو نهج كمي لتحديد مستويات انزيم نشط في عدد السكان.

1. التحضير لهذا الفحص:
   1. قياس OD ₆₀₀ لكل عينة.
   2. إعداد المبلغ اللازم من D-وسيفيرين اللازمة بناء على عدد من العينات والمطلوب عدد من مكررات بالإضافة إلى ما يقرب 1،200 ميكرولتر للأنابيب. تركيز النهائي من D-وسيفيرين هو ~ 23 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر من الخلايا. في البداية يتم حله في الماء بتركيز محلول المخزون من 7.5 ملغ / مل وتخفيفه إلى 455 ميكروغرام / مل في SC قبل التجربة. في الشكل 2، وثلاثة مكررات لتم تحليل كل عينة مما أدى إلى ما مجموعه 2.4 مل من D-وسيفيرين المستخدمة.
   3. برنامج قارئ لوحة للفلاش وميمقايسة nescence (مقتبس من BIOTEK Gen5 "التلألؤ الفحص فلاش مع حقن"؛ لصكوك أخرى اتبع تعليمات الشركة الصانعة)
      1. ضبط درجة الحرارة إلى 30 ° C
      2. تعيين قارئ لوحة لإضافة D-وسيفيرين، يهز، وقراءة كل بئر على حدة.
      3. قراءة التلألؤ (القراءة نقطة النهاية، 5 ثانية الوقت التكامل، ومستوى الحساسية 180)
      4. لفحص الانتعاش بين كل هزة القراءة لمدة 5 دقائق، وتأخير 20 دقيقة، ويهز في 5 دقائق إضافية.
      5. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من D-وسيفيرين من حاقن.
2. يتم قياس التلألؤ سخن للصدمة مباشرة بعد يتم إضافة خلايا إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على سيكلوهيكسيميد لوقف تخليق البروتين.
   1. نقل 100 ميكرولتر من الخلايا لكل عينة مع العدد المرغوب فيه من يعيد إلى مادة صلبة بيضاء 96 لوحة جيدا.
   2. وينبغي أن تشمل الضوابط فارغة المياه والخلايا التي تحتوي على ناقلات الفارغة.
   3. ابدأ القراءة مع جمعية مهندسي البترولcifications المذكورة أعلاه.
3. لتفسد شاردة FFL من FFL-GFP، احتضان ثقافة مل 5 في أنبوب الثقافة زجاج في 42 ° C الهز لمدة 25 دقيقة.
4. انتعاش فحص قراءات التلألؤ تبدأ على الفور بعد إزالة الخلايا من الحاضنة، والتي حان الوقت نقطة الصفر. مقياس التألق نفسها كما هو موضح أعلاه لأول مرة نقطة وكل 30 دقيقة لمدة 90 دقيقة.
5. تطبيع عينات لتسخين للصدمة القيم التلألؤ التي تم تعديلها بناء على OD ₆₀₀ (تقسيم القيم سخن للصدمة من قبل OD _600).

4. المجهر مضان

هذا الاختبار هو وسيلة شبه كمي لتحديد الانحلالية من المجاميع على مر الزمن في عدد السكان من الخلايا.

1. الاستقراء هو نفسه كما هو موضح في القسم 2، والخطوات 1-8 من البروتوكولات.
2. تؤخذ النقاط نفس الوقت كما هو موضح أعلاه (القسم 3، الخطوة 4)، ولكن لهيئة التصنيع العسكريroscopy جمع 1 مل من الخلايا في سخن للصدمة وكل نقطة زمنية استرداد، وعينات احتضان الدورية عند 30 درجة مئوية في أنبوب الثقافة.
3. التصور:
   1. أجهزة الطرد المركزي 1 مل من الخلايا في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وإزالة الطافي.
   2. Resuspend الخلية بيليه في 2 ميكرولتر من DDH ₂ O.
   3. خلط 2 ميكرولتر من الخلايا زائد 2 ميكرولتر من 2٪ منخفضة ذوبان الاغاروز على الشريحة وإضافة انزلاق الغطاء. من أجل الحصول على طائرة واحدة من الخلايا برفق اضغط الإصبع إلى أسفل في وسط من انزلاق الغطاء وتدوير حتى زلة تغطية من الصعب للتحرك.
   4. الخلايا هي تصور باستخدام هدف النفط 100X على المجهر الفلورسنت، واستخدام مدينة دبي للإنترنت لتصور الخلايا وتصفية FITC لتصور GFP مضان.
   5. التقاط صور متعددة لكل سلالة في كل نقطة زمنية لتحديد الكميات. يجب الحقول للحصول على صور تحتوي على 15-30 ~ الخلايا لتحليل ما بعد التجريبية الكمي.
   6. لحساب النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على المجاميع، عد 50مجموع الخلايا -100 وتقسيم عدد من الخلايا التي تحتوي على المجاميع.

5. الميكروسكوب خلية واحدة

وتستخدم هذه الطريقة لمتابعة الانحلالية من المجاميع الفردية في خلية واحدة على مر الزمن.

1. لحث FFL-GFP التعبير كما هو موضح في القسم 2، والخطوات 1-8.
2. ما بعد الصدمة الحرارية، والخلايا الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
3. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر من المياه وresuspend في 20 ميكرولتر من DDH ₂ O.
4. لكل سلالة، وقطع جزء مم 5X5 لوحة آغار SC-URA واستخدام السطح الذي كان على اتصال مع طبق بتري، ماصة 4 ميكرولتر من الخلايا وانتشارها في جميع أنحاء سطح أجار مع طرف ماصة. اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة ~.
5. استخدام ملاقط لوضع القسم مكعب أجار وجها لأسفل على ~ 55 مم أسفل الزجاج طبق رقم 0 واضغط لأسفل برفق.
6. التصور:
   1. انظر الأول إلى الثالث في الطائفةأيون 4.
   2. مجموعة تنسق لمدة 2-4 نقاط الاتصال لكل سلالة اعتمادا على كثافة الثقافة.
   3. ضبط الكاميرا لالتقاط الصور مع Z-مكدس مع مجموعة مناسبة (- / + 15 ميكرون مع 0.5-1.0 ميكرون شريحة سمك) كل 5 دقائق لمدة دقيقة 90.

النتائج

الخميرة تعتمد على disaggregase، Hsp104 إلى refold البروتينات حرارة التشويه والتحريف بكفاءة. تم رصد نشاط FFL-GFP بعد الصدمة الحرارية دقيقة 25، وذلك باستخدام التلألؤ فلاش فحص الشكل 1. وكشفت نتائج هذا الفحص الآلي هو مبين في الشكل 2 الزيادة التدريجية في النشاط أكثر من 90...

Discussion

في هذه المقالة نموذج البروتين كانت تستخدم FFL-GFP تبين أن disaggregase الخميرة، Hsp104 يساهم في البروتين إعادة الانحلالية والإصلاح. المقايسات الأنزيمية والفحص المجهري استجواب تفاضلي حالة من البروتين الركيزة نفسه لتحديد طوي ثانية كفاءة وانتاجية. نتائج فحوصات الانتعاش الأنزيمي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484