מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Summary

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור In vivo קיפול חלבונים ב Cerevisiae Saccharomyces. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostasis בבקרת איכות חלבון.

Abstract

Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות ^1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון ^10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ 'isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים ^12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של ​​הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase ¹³ Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת ^5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.

Introduction

אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה ^10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני ⁶ misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה ^19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ^{ב18 vivo, 7.} היכולת לנתח מתקפל עם רזולוציה קרובה זמן אמת יקל להבין כיצד גורמים נוספים המשך הסלולריribute לתהליך Hsp70 תלוי זה. בנוסף, קיפול / refolding תגובות לא יכול להיות תלוי לחלוטין בחלבונים התורמים אלה, ולכן מבחני חייבים להיות רגישים מספיק כדי לזהות את שני שינויים גדולים וקטנים בקינטיקה ויעילות.

Disaggregase תא השמרים, Hsp104, ממלא תפקיד חיוני בתיקון חלבוני misfolded מצטברים. למרות Hsp104 homologs זוהה בפטריות וצמחים, משפחה זו מופיעה להיעדר בmetazoans. זה הוצע כי מלווים אחרים, כגון אלו של משפחת Hsp110 לבצע חלק מפעילויות Hsp104 הידועות ביונקים ^16. Hsp104 הוא +, חלבון מורכב hexameric AAA שמתפקד בשמרים לאגרגטים חלבון לשפץ, שתרם לrefolding ותיקון ^13. Hsp104, יחד עם שמרי Hsp70, Ssa1, ושמרי Hsp40, Ydj1, נדרש להתאוששות של FFL מפוגל בשמרי תאים ^{5, 8.} החלבון הקטן חום ההלם, Hsp26, גם הוכח להיות requiאדום לdisaggregation Hsp104 בתיווך של FFL ^2.

FFL הוא חלבון שני תחום שנקשר luciferin המצע באתר הפעיל ובעקבות שינוי קונפורמציה שדורש ATP וחמצן, decarboxylates מצע שחרור oxyluciferin, פחמן דו חמצני (CO _2), monophosphate אדנוזין (AMP), ו ^{-11 קלות, 9, 3.} המצע זמין מסחרי FFL, D-luciferin, התוצאות בפליטת אור בין 550-570 ננומטר שניתן לאתר באמצעות luminometer ^15. FFL הוא רגיש להפליא denaturation מטיפולים כימיים או חום ואגרגטים במהירות על התגלגלות. בעת חשיפה לטמפרטורות שבין 39-45 מעלות צלזיוס FFL הוא פרש הפיך ^ו12 מומתים. לעומת זאת, ה-GFP ונגזרותיו הם עמידים מאוד לחלבון התגלגלות לחצים ^14. לכן שילוב של שני החלבונים האלה מאפשר FFL לתפקד כמחצית ניסוי יציבה מסוגלת מיקוד G הפונקציונליFP לתאי פיקדונות שניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהוא על האוכלוסייה ורמות תא בודדות. יישום של assay אנזימטי בקורא צלחת multimode חצי אוטומטית בשילוב עם מיקרוסקופ האוטומטי מאפשר הערכה בו זמנית חסרת תקדים של קינטיקה תשואה של refolding תגובות. בנוסף, הגנטיקה המולקולרית הקלילה של cerevisiae Saccharomyces eukaryote המודל מאפשרת גם מניפולציה מדויקת של רשת בקרת איכות החלבון ואת ההזדמנות לגילוי המבוססים על גישות חדשניים כדי לזהות שחקנים שתרמו לתגובת לחץ התאי וproteostasis.

במחקר זה, זני הבר מסוג (WT) וHSP104 מחיקה להביע FFL-GFP כפופים להלם חום denaturing חלבון. refolding FFL-GFP הוא פיקוח באמצעות שניהם assay אנזימטי ומיקרוסקופיה כreadout proxy עבור תיקון של proteome בא לידי ביטוי לאורך כמובן זמן התאוששות. בהשוואה לתאי WT, אנו מראים הזן מחיקת Hsp104 דואר הוא ~ 60% פחות יעיל בrefolding FFL-GFP, התומכים בממצאים קודמים הקמת תפקיד לHsp104 בהפעלה מחדש של מפוגל FFL ^2.

Protocol

1. בנייה של זנים המכילים FFL-GFP פלסמיד

במחקר זה, זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) שימש יחד עם מתח מחיקת HSP104 מאוסף נוקאאוט שמרים (הפתוח Biosystems / Thermo Scientific). המחיקה אושרה באמצעות נוגדן ספציפי לHsp104 ניתוח כתם מערבי.

FFL-GFP בא לידי ביטוי מp426MET25-FFL-GFP, שנבנה ממקור פלסמיד מבוסס LEU2 התקבל מהמעבדה גלובר באוניברסיטת טורונטו ¹⁷ והשגה, על פי בקשה למחברים. הביטוי של חלבון היתוך פלסמיד FFL-GFP נשלט על ידי אמרגן מתיונין-repressible MET25. פלסמיד הפך לכל זן באמצעות פרוטוקול הותאם מGietz et. אל, 1995:

1. צנטריפוגה 25 מ"ל O f תאי שלב יומן בצינור חרוטי 50 מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 2 דקות, לשטוף עם 500 μl של מזוקק H הכפול ₂ 0 (DDH ₂ O), וזורקים supernate.
2. תאי Resuspend ב 250 μl של TE / LiAc (טריס-HCl 10 מ"מ, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 אצטט ליתיום מ '). לדגור על 30 מעלות צלזיוס, ללא ערבוב במשך 20 דקות.
3. העבר את 50 μl של תאים מוסמכים לצינור חדש יחד עם 5 מ"ל (50 מיקרוגרם) של ה-DNA ומנשא 5 μl (0.1-5 מיקרוגרם) של ה-DNA פלסמיד. הוסף 300 μl של PEG / TE / LiAc (אותו הדבר כמו פוליאתילן גליקול% TE / LiAc בתוספת 40) לתערובת זו, ותאים לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספת.
4. הוסף נפח 1/10 (V / V) DMSO (36 μl) לתערובת זו והלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות.
5. צנטריפוגה תערובת על 6,000 סל"ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. Resuspend תאים ב100 μl של ₂ 0 תאים בצלחת DDH סטריליות על גבי מדיה שלמה סינטטי חסרות אורציל (SC-אורה).

2. אינדוקציה של FFL-GFP

NT "> FFL-GFP הוא מושרה ברגע תאים נמצאים בשלב יומן כך שרוב החלבון לפני חום ההלם הוא עשה זה עתה, כדי למנוע חלבונים שהסתכמו סופני לאורך זמן עקב ליקויים הקשורים להזדקנות הסלולר.

1. יום 1: תאי דגירה ב5 מ"ל של SC-URA ב 30 מעלות צלזיוס מסתובב O / נ
2. יום 2: מדוד OD ₆₀₀ ותרבויות טריות בלחסן 5 מ"ל של SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0.2.
3. דגירה תרבויות עם סיבוב על 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים יומן השלב OD ₆₀₀ ~ 0.8-1.0.
4. צנטריפוגה תאים ב15 צינורות חרוטי מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 3 דקות, למזוג supernate ו resuspend תא גלולה ב 500 μl של DDH ₂ 0; פתרון טרנספר לצינור microcentrifuge.
5. צנטריפוגה ב -6,000 סל"ד וזורקים supernate.
6. Resuspend תאי 5 מ"ל של SC-URA-נפגש. תאים צריכים להיות מודגרות מסתובב באת המדיה עבור שעת 1 ב 30 ° C.
7. תאי צנטריפוגות וחזור על לשטוף בDDH ₂ 0 וזורקים supernate.
8. Resuspeתאי nd ב5 מ"ל תקשורת SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של cycloheximide לעכב ביטוי חלבון, ופנה מייד לשלב 3.

3. Assay שחזור FFL-GFP האנזימטית

assay זה הוא גישה כמותית כדי לקבוע את רמות האנזים פעיל באוכלוסייה.

1. הכנה לassay זה:
   1. מדוד OD ₆₀₀ עבור כל דגימה.
   2. הכן את הסכום דרוש של D-luciferin צורך בהתבסס על מספר הדגימות ומספר החזרות בתוספת כ -1,200 μl לצינורות רצוי. ריכוז סופי של D-luciferin הוא ~ 23 מיקרוגרם לכל 100 μl של תאים. תחילה הוא מומס במים בריכוז פתרון מניות של 7.5 מ"ג / מ"ל ​​ובדילול ל455 מיקרוגרם / מ"ל ​​בSC לפני הניסוי. באיור 2, שלוש משכפל עבור כל דגימה נבדקו וכתוצאה מכך הסכום כולל של 2.4 מ"ל של D-luciferin בשימוש.
   3. תכנית צלחת קורא לבזק לומיassay nescence (עיבוד "Assay הארת פלאש עם הזרקה" BioTek Gen5; למכשירים אחרים פעלו בהתאם להוראות יצרן)
      1. הגדר טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס
      2. הגדר קורא צלחת להוסיף D-luciferin, לנער, ולקרוא היטב כל אחד בנפרד.
      3. קרא את הארה (נקודת סיום קריאה, 5 שניות זמן אינטגרציה, רמת רגישות 180)
      4. עבור assay ההתאוששות בין כל קריאה לנער במשך 5 דקות, 20 דקות עיכוב, ולנער את 5 דקות נוספות.
      5. לוותר על 50 μl של D-luciferin ממזרק.
2. הארה מחממים ההלם נמדדה מייד לאחר הוספת תאים לתקשורת המכיל cycloheximide לעצור סינתזת חלבון.
   1. העברת 100 μl של תאים עבור כל דגימה עם מספר רצוי של משכפל לתוך צלחת 96 היטב מוצקה לבנה.
   2. בקרה צריכה לכלול ריק מים ותאים המכילים וקטור ריק.
   3. התחל לקרוא עם SPEcifications מפורט לעיל.
3. כדי לפגל מחצית FFL של FFL-GFP, דגירה תרבות 5 מ"ל בצינור זכוכית תרבות על 42 מעלות צלזיוס רעד במשך 25 דקות.
4. קריאות הארה assay שחזור להתחיל מייד לאחר תאים יוסרו מן החממה, שהוא אפס נקודת זמן. מידת הארה זהה למתואר לעיל לנקודת הזמן הראשונה וכל 30 דקות במשך 90 דקות.
5. לנרמל את הדגימות לערכי הארה-הלם מחממים שהותאמו על בסיס OD ₆₀₀ (לחלק את הערכים מחממים-הלם על ידי OD _600).

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

assay זה הוא שיטה חצי כמותית כדי לקבוע solubilization של אגרגטים לאורך הזמן באוכלוסייה של תאים.

1. אינדוקציה היא אותו כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8 של פרוטוקולים.
2. אותן נקודות הזמן נלקחות כמתואר לעיל (סעיף 3, שלב 4), אבל למיקרופוןroscopy לאסוף 1 מ"ל של תאים במחממים בהלם וכל נקודת זמן החלמה, ודגימות דגירה מסתובבות ב 30 מעלות צלזיוס בצינור התרבות.
3. ויזואליזציה:
   1. צנטריפוגה 1 מ"ל של תאים ב 6000 סל"ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate.
   2. Resuspend תא גלולה ב2 μl של DDH ₂ O.
   3. מערבבים 2 μl של תאים בתוספת 2 μl של 2% הנמוך להמיס agarose בשקופית ולהוסיף להחליק את המכסה. על מנת לקבל מישור אחד של תאים לחצו קל את האצבע כלפי מטה במרכז להחליק את המכסה ולסובב עד להחליק את המכסה קשה לזוז.
   4. תאים הם דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X במיקרוסקופ פלואורסצנטי; להשתמש דסק"ש לדמיין תאים ומסנן FITC לדמיין הקרינה ה-GFP.
   5. קח את התמונות מרובות עבור כל זן בכל נקודת זמן כדי לכמת. שדות עבור תמונות צריכים להכיל 15-30 ~ תאים לניתוח שלאחר הניסוי כמותי.
   6. כדי לחשב את אחוז התאים המכילים אגרגטים, לספור 50תאי -100 הכוללים ולחלק את מספר התאים המכילים אגרגטים.

5. מיקרוסקופית תא בודד

שיטה זו משמשת למעקב solubilization של אגרגטים בודדים בתא בודד לאורך זמן.

1. לגרום ביטוי FFL-GFP כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8.
2. לאחר הלם חום, תאי צנטריפוגות בצינור חרוטי 15 מ"ל ב 4,400 סל"ד במשך 2 דקות.
3. שטוף תאים עם 500 μl מים וresuspend ב 20 μl של DDH ₂ O.
4. לכל זן, לחתוך את קטע של 5x5 מ"מ צלחת אגר SC-URA ושימוש במשטח שהיה במגע עם צלחת פטרי, פיפטה μl 4 תאים והתפשטו ברחבי פני השטח של אגר עם קצה פיפטה. לתת לעמוד במשך דקות ~ 1.
5. להשתמש בפינצטה למקום סעיף קובייה אגר עם פנים כלפי מטה על ~ 0 צלחת תחתית זכוכית 55 מ"מ מס ולחץ כלפי מטה בקלילות.
6. ויזואליזציה:
   1. ראה I-III בכתיון 4.
   2. להגדיר קואורדינטות עבור 2-4 מוקדים לכל זן בהתאם לצפיפות של התרבות.
   3. הגדר את המצלמה כדי לצלם תמונות עם Z-מחסנית עם הטווח מתאים (- / + 15 מיקרומטר עם עובי פרוס מיקרומטר 0.5-1.0) כל 5 דקות לתקופה 90 דקות.

תוצאות

השמרים תלויים בdisaggregase, Hsp104 לקפל חלבוני חום מפוגלים ביעילות. הפעילות של FFL-GFP הייתה פיקוח אחרי 25 דקות הלם חום, באמצעות assay הבזק הארה איור 1. את התוצאות של assay האוטומטי זו שמוצגת באיור 2 נחשפו עלייה הדרגתית בפעילות מעל 90 דקות שסופו של דבר הובילו להתאוששות&...

Discussion

במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484