의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

요약

이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 - GFP 융합 단백질의 사용을 설명합니다 생체 내의 단백질 폴딩 사카 cerevisiae의. 모델 열 변성 된 단백질의 접힘이 시약을 사용하면 형광 현미경 및 단백질 품질 관리 proteostasis 네트워크 구성 요소의 역할을 조사하는 효소 분석에 의해 동시에 모니터링 할 수 있습니다.

초록

단백질 폴딩 / 생합성의 통합 프로세스로 정의 Proteostasis는 재 접힘 / 수리, 그리고 성능 저하, 해로운 결과 ^1을 방지하기 위해 유지해야하는 섬세한 세포의 균형이다. 이 균형을 방해 외부 또는 내부 요인 단백질 응집, 독성 및 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 인간이는 헌팅턴의, 파킨슨, 알츠하이머 병 ¹⁰ 신경 퇴행성 질환과 관련된 증상에 대한 주요 기여 요소이다. 그것은 proteostasis의 유지 보수에 관련된 단백질이 쇠약 질병에 대한 치료법을 개발하기 위해 확인하는 것이 필수적이다. 이 문서에서는 녹색 형광 단백질 (FFL-GFP)을 융합 한 모델 단백질 반딧불 루시 페라 제를 사용하여 실시간에 가까운 해상도로 생체 내 단백질 폴딩의 모니터링을위한 기술을 설명합니다. FFL 부분은 스트레스 유발 m에 매우 민감로 FFL-GFP는 고유 모델 키메라 단백질효소 ¹² 불 활성화 isfolding 및 집계. 루시 페라 제 활동은 효소 분석을 사용하여 모니터링하고, GFP 부분은 자동화 된 현미경을 사용하여 수용성 또는 집계 FFL을 시각화하는 방법을 제공합니다. 이러한 결합 방법은 재 접힘과 스트레스 후 효소의 기능을 재 활성화 모두를 분석하기 위해 두 개의 병렬 기술적으로 독립적 인 접근 방식을 통합합니다. 활동 복구는 직접 더 나은 이러한 단백질 보호자와 같은 단백질 품질 관리 요소가 이러한 기능을 수행하기 위해 협력하는 방법을 이해하기 위해 세분화하고 다시 가용화 반응 속도와 상관 될 수 있습니다. 또한, 유전자 삭제 또는 돌연변이는이 과정에 특정 단백질 또는 단백질 소단위의 기여를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는이 방법의 유효성을 검사하는 단백질 재 접힘에 시스템 ⁵ 접힘 Hsp40/70/nucleotide 교환 계수 (NEF) 파트너로 알려진 단백질 disaggregase Hsp104 ^{13 일의} 기여를 검사합니다.

서문

인간의 알츠하이머, 파킨슨 병, 헌팅턴의 질환 등 퇴행성 신경 질환은 단백질의 misfolding 및 집계 ^10에 연결되어있다. 세포는 잘못 접힌 비활성 구조 ^6으로 세포 단백질의 운동 포획을 방지하기 위해 분자 보호자를 사용합니다. 보호자는 세포 내의 복잡한 상호 작용 네트워크에 참여하지만, 그것은 완전히 이러한 상호 작용의 합이 생명체의 proteostasis에 기여하는 방법을 이해하지 않습니다. 세포질 단백질 폴딩의 대부분을 담당하는 주 보호자의 하나는 70 kD의 열 충격 단백질 (Hsp70의) 가족 ^19이다. 이 표시되었음을 Hsp70의 감소 효모 손실 초기 발현 된 FFL을 접을 생체 ^{18, 7} 내인성 단백질, 오르니 틴 transcarbamoylase를 재 접힘 할 수있다. 실시간에 가까운 해상도로 접는 분석 할 수있는 능력은 이해를 촉진하는 방법을 추가로 휴대 요인 연속이 Hsp70의 종속 프로세스에 ribute. 또한, 폴딩 / 반응 접힘은이 기여하는 단백질에 완전히 의존하지 않을 수 있으므로 분석은 반응 속도와 효율성에 크고 작은 변화를 모두 감지 할 정도로 민감해야합니다.

효모 세포 disaggregase, Hsp104는 집계 잘못 접힌 단백질을 수리에서 중요한 역할을합니다. Hsp104 상동는 곰팡이와 식물에서 발견되었지만,이 가족은 후생에없는 것 같습니다. 이 같은 Hsp110 가족들과 같은 다른 보호자는 포유류 ¹⁶ 알려진 Hsp104 활동의 일부를 수행 할 것을 제안하고있다. Hsp104는 AAA +, hexameric 단백질 복합체입니다 리모델링 단백질 집계에 효모의 기능, 재 접힘 및 수리 ^13에 기여. Hsp70의 효모, Ssa1, 그리고 효모 Hsp40, Ydj1와 함께 Hsp104는, 효모 세포 ^{5, 8} 변성 FFL을 복구해야합니다. 작은 열 충격 단백질, Hsp26은 또한 requi 것으로 표시되었습니다FFL ² Hsp104 매개 세분화 빨간색.

FFL은 기판의 활성 부위에있는 루시페린과 ATP, 산소, decarboxylates을 필요로하는 구조적 변화에 따라 바인딩 두 개의 도메인 단백질 oxyluciferin, 이산화탄소 (CO _2), 아데노신 일 인산염 (AMP), 가벼운 ^11를 풀어 기판 ^{9, 3.} 상업적으로 이용 가능한 FFL 기판, D-루시페린, luminometer ^15를 사용하여 검색 할 수 있습니다 550-570 nm의 사이에 발광 결과. FFL은 전개시 화학 물질 또는 열처리 빠르게 집계에서 변성을 정교하게 구분합니다. 39-45 사이의 온도에 노출되었을 때 ° C FFL은 가역적으로 전개 및 비활성화 ^12입니다. 반면, GFP 및 그 유도체는 스트레스 ¹⁴ 전개 단백질이 뛰어납니다. 따라서이 두 단백질의 융합 기능 G를 타겟팅 할 수있는 실험적으로 불안정한 부분의 기능을 FFL 수 있습니다FP는 인구와 단일 세포 수준 모두에서 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 예금을 세포 내. 자동화 된 현미경과 결합 반자동 멀티 플레이트 리더 효소 분석의 응용 프로그램 속도론 및 반응 접힘 수율의 전례없는 동시 평가를 할 수 있습니다. 또한, 모델 진핵 생물 인 Saccharomyces cerevisiae의의 손쉬운 분자 유전학 정확한 단백질 품질 관리 네트워크의 조작과 세포 스트레스 반응 및 proteostasis에 기여하는 새로운 플레이어를 식별하는 검색 기반의 접근 기회를 모두 할 수 있습니다.

본 연구에서는 FFL-GFP를 표현 야생형 (WT)와 HSP104 삭제 변종 단백질 변성 열 충격을받습니다. FFL-GFP의 재 접힘은 복구 시간 과정을 통해 표현 프로테옴의 수리를 위해 프록시 판독 등의 효소 분석 및 현미경 모두를 통해 모니터링됩니다. WT 세포에 비교하면, 우리는 일을 보여전자 Hsp104 삭제 균주는 변성 FFL ^2의 재 활성화에 Hsp104의 역할을 확립 이전의 연구를 지원, FFL-GFP를 접힘시 ~ 60 % 덜 효율적이다.

프로토콜

1. 플라스미드 FFL-GFP를 포함 균주의 건설

본 연구의 경우, 사카 cerevisiae의 변형 BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0)는 효모 녹아웃 컬렉션 (오픈 바이오 시스템 / 온도 과학)에서 HSP104 삭제 변형과 함께 사용되었다. 삭제가 서양 얼룩 분석을 위해 Hsp104 특정 항체를 사용하여 확인 하였다.

FFL-GFP는 저자에게 요청 토론토 ¹⁷ 대학교 얻을에서 글로버 실험실에서 얻은 플라스미드 LEU2 기반의 소스로부터 구성, p426MET25-FFL-GFP의 표현되었다. FFL-GFP 플라스미드 융합 단백질의 발현은 MET25 메티오닌 - repressible 프로모터에 의해 제어됩니다. 플라스미드는 Gietz 등에서 적응 된 프로토콜을 사용하여 각 균주에 형질 전환 하였다. AL, 1995

1. 25 ML (을)를 원심 분리 2 분 동안 4,400 rpm에서 50 ML 원뿔 튜브 F 로그 상 세포는 두 번 증류수 H ₂ 0 (DDH ₂ O) 500 μL로 씻어 supernate 버립니다.
2. TE / LiAc (트리스 - 염산 10 MM, 산도 = 7.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 M 리튬 아세테이트) 250 μL의 세포를 resuspend. 20 분 동안 혼합하지 않고 30 ° C에서 알을 품다.
3. 캐리어 DNA의 5 ML (50 μg)와 플라스미드 DNA의 5 μL (0.1 ~ μg)과 함께 새로운 튜브에 유능한 세포의 50 μl를 전송합니다. PEG / TE / LiAc (TE / LiAc 플러스 40 % 폴리에틸렌 글리콜과 같은)이 혼합물에 300 μl를 추가하고 ° C로 30 분 30 세포를 품어.
4. 6 분 동안 42에서이 혼합물 및 열 충격 ° C에 1 / 10 부피 (v / v)의 DMSO를 (36 μL)를 추가합니다.
5. 30 초 및 제거 supernate 6,000 rpm에서 혼합물을 원심 분리기. 우라실 (SC-URA)을 부족 합성 완벽한 매체에 멸균 DDH ₂ 0과 플레이트 세포 100 μL의 세포를 resuspend을.

2. FFL-GFP 유도

이전의 열 충격 단백질의 대부분은 새로 말기 노화 관련 세포의 부적절로 인해 시간이 지남에 따라 집계 한 단백질을 방지하기 위해 만든 그래서 세포가 로그 상에 한 번 NT는 "> FFL-GFP가 유도된다.

1. 1 일 : 30 SC-URA 5 ㎖의 세포를 품어 ° C 회전 O / N.
2. 주 2 : 측정 OD ₆₀₀ SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0.2 5 ㎖에 접종 신선한 문화.
3. 그들은 로그 단계 OD ₆₀₀ ~ 0.8 ~ 1.0에 도달 ° C까지 30 회전 문화를 품어.
4. DDH ₂ 0 500 μL에 3 분, 가만히 따르다 supernate 및을 Resuspend 세포 펠렛을 위해 4,400 rpm에서 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 원심 분리, microcentrifuge 관에 전송 솔루션을 제공합니다.
5. 6,000 rpm에서 원심 분리 supernate 버린다.
6. SC-URA-MET 5 ㎖의 세포를 resuspend을. 세포는 30 ℃에서 1 시간 동안이 미디어에서 회전 배양해야한다
7. 원심 분리기 세포와 반복 DDH ₂ 0 씻어 supernate 버립니다.
8. Resuspe100 ㎍ / 단백질 발현을 억제하고, 3 단계로 바로 진행 cycloheximide의 ML을 포함하는 10 ML SC-URA 미디어에서 차 전지.

3. 효소 FFL-GFP 복구 분석

이 분석은 인구 활성 효소의 수준을 결정하는 정량적 인 방법입니다.

1. 이 분석을위한 준비 :
   1. 각 샘플의 OD _600을 측정합니다.
   2. D-루시페린의 필요한 양을 준비하는 것은 샘플의 수를 기반으로 복제 갯수 튜브 약 1,200 μl를 원하는했습니다. D-루시페린의 최종 농도는 세포 100 μL 당 ~ 23 μg이다. 처음에이 7.5 밀리그램 / ML의 원액 농도에서 물에 용해되어 이전의 실험 455 ㎍ / SC에서 ML로 희석. 각 샘플은 D-루시페린이 사용되는 2.4 ML의 총에서 발생 하였다는 그림 2에서는 세 복제합니다.
   3. 플래시 루미위한 프로그램 플레이트 리더nescence 분석 (BioTek GEN5 "주입 발광 플래시 분석"에서 적응하며 다른 악기 제조 업체의 지침을 따르십시오 경우)
      1. 30 ° C로 온도를 설정
      2. , D-루시페린을 추가 흔들어 개별적 잘 읽어 플레이트 리더를 설정합니다.
      3. 발광을 읽고 (엔드 포인트 읽기, 5 초 적분 시간, 180 감도 레벨)
      4. 5 분마다 독서 동요 사이에 복구 분석을 위해 20 분 지연 및 추가 5 분 흔들.
      5. 인젝터에서 D-루시페린의 50 μl를 분배.
2. 세포는 단백질 합성을 중단 cycloheximide를 포함하는 미디어에 추가 한 후 예열 충격 발광은 즉시 측정한다.
   1. 단색 흰색 96 웰 플레이트에 복제의 원하는 번호와 함께 샘플 세포를 100 μl를 전송합니다.
   2. 컨트롤은 물을 빈 빈 벡터를 포함하는 세포를 포함해야합니다.
   3. SPE와 읽기를 시작합니다cifications 위에 나열된.
3. FFL-GFP의 FFL 부분을 변성, 42에서 유리 문화 튜브에 5 ML 문화를 품어 ° C 25 분 동안 흔들어.
4. 세포는 시점 0입니다 인큐베이터에서 제거 된 후 복구 분석 발광 판독이 즉시 시작됩니다. 처음 점과 90 분마다 30 분 동안 위에서 설명한 동일한 측정 발광.
5. OD ₆₀₀ (OD _600로 예열 충격 값을 분할)에 따라 조정되었습니다 예열 충격 발광 값으로 샘플을 정상화.

4. 형광 현미경

이 분석은 세포의 인구에서 시간이 지남에 따라 골재의 가용화를 결정하는 정량적 인 방법입니다.

1. 유도 2 절에 설명 된대로 동일한 프로토콜의 1-8 단계를 반복합니다.
2. 동시에 점 (제 3, 4 단계) 위에서 설명한대로 수행되지만 마이크에 대한roscopy 1 예열 충격에서 세포의 ML 각 복구 시점 및 ° C 배양 관에서 30 회전 부화 샘플을 수집합니다.
3. 시각화 :
   1. 30 초 및 제거 supernate 6,000 rpm에서 전지 1 ㎖를 원심 분리기.
   2. DDH ₂ O 2 μL의 세포 펠렛을 Resuspend
   3. 셀 플러스 슬라이드에 2 % 낮은 용융 아가로 오스 2 μL 2 μL를 혼합 커버 슬립을 추가합니다. 세포의 단일 비행기를 얻기 위해 가볍게 커버 슬립의 중앙에 손가락을 아래로 눌러 커버 슬립 이동하기 어려울 때까지 돌립니다.
   4. 세포는 형광 현미경 100X 오일 목표를 사용하여 시각화, GFP의 형광을 시각화하는 세포와 FITC 필터를 시각화하는 DIC 사용합니다.
   5. 정량 각 시점에서 각 변형에 대한 여러 사진을 촬영합니다. 사진에 대한 필드는 양적 사후 실험 분석을 위해 ~ 15-30 세포를 포함해야합니다.
   6. 집계를 포함하는 세포의 비율을 계산하려면 50을 계산-100 세포는 총 집계를 포함하는 셀의 수를 나눕니다.

5. 단일 셀 현미경

이 방법은 시간이 지남에 따라 단일 셀에서 개별 집계의 가용화를 따라하는 데 사용됩니다.

1. 제 2 장에서 설명한대로 FFL-GFP의 발현을 유도, 1-8 단계를 반복합니다.
2. 후 열 충격, 2 분 동안 4,400 rpm에서 15 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 세포.
3. DDH ₂ O 20 μL에 물을 Resuspend 500 μL와 세포를 씻으
4. 각 변형에 대해, SC-URA 한천 플레이트 5X5 mm 섹션을 잘라 페트리 접시, 피펫 팁과 한천의 표면 주위 세포의 확산 μL 피펫 4와 접촉 한 표면을 사용. ~ 1 분 동안 서 보자.
5. ~ 55mm 유리 바닥 요리의 번호 0에 얼굴을 아래로 한천 큐브 섹션을 배치하고 가볍게 눌러 핀셋을 사용합니다.
6. 시각화 :
   1. 분파에 I-III를 참조하십시오이온 4.
   2. 세트는 문화의 밀도에 따라 각 균주 2-4 초점 포인트에 대한 좌표.
   3. (- 0.5-1.0 μm의 슬라이스 두께 / + 15 μM) 90 분 동안 5 분마다 적절한 범위 Z-스택 사진을 찍을 카메라를 설정합니다.

결과

효모 disaggregase에 의존, Hsp104 효율적으로 열 변성 단백질을 재 접힘 수 있습니다. FFL-GFP의 활동은 발광 플래시 분석 그림 1을 사용하여, 25 분 열 충격 후 측정 하였다. 그림 2에서와 같이이 자동화 된 분석의 결과는 궁극적으로 WT 세포의> 80 % 회복했다 90 분 이상 활동 단계적 증가를 발표했다. hsp104Δ 변형은 동일한 시간 프레임에 원래 활동의 19 %를 회복. 또한, 초기...

토론

이 문서에서는 모델 단백질은 FFL-GFP는 효모 disaggregase이 Hsp104 단백질 재 가용화 및 수리에 기여하는 것을 보여주기 위해 사용되었다. 효소 분석과 현미경 차동 접힘 효율과 수율을 결정하기 위해 동일한 기판 단백질의 상태를 심문. 효소 복구 분석의 결과는 비효율적 hsp104D 균주의 최대 복구 만이 아니다하는 것이 좋습니다,하지만 전개 스트레스의 초기 크기는 돌연변이 균주 (그림 2)?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484