耦合检测监控蛋白复性<em&gt;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）</em

摘要

本文介绍了利用萤火虫荧光素-GFP融合蛋白进行调查在地体内蛋白质折叠酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。使用这种试剂，可同时监控一个模型的热变性蛋白复性，通过荧光显微镜和酶法测定蛋白质的质量控制中，以探测作用的proteostasis网络组件。

摘要

proteostasis，定义为蛋白质折叠/生物合成的组合过程中，复性/维修，和退化，必须维护，以避免有害的后果¹细胞是一个微妙的平衡。外部或内部因素破坏这种平衡可以导致蛋白质聚集，毒性和细胞死亡。对于人类来说，这是一个主要因素与神经退行性疾病相关的症状，如亨廷顿氏，帕金森氏症和阿尔茨海默氏病^10。因此，它是必不可少的蛋白质参与维护proteostasis的被确定为了开发这些使人衰弱的疾病的治疗方法。本文中所描述的技术用于监测体内蛋白质折叠使用的模型蛋白萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白（FFL-GFP）融合，以接近实时的时间分辨率。 FFL-GFP是一个独特的模型嵌合的蛋白质，FFL部分是极其敏感的应激诱导米isfolding和聚合，失活的酶^12。监测使用酶法测定荧光素酶活性，在GFP部分提供了一种方法，可视化的水溶性或凝集的平板荧光灯用自动化显微镜。这些耦合的方法包括两个平行和技术上独立的方法来分析应力后一种酶复性和功能重新。恢复活性，可直接与分类和重溶动力学，以便更好地了解蛋白质的质量控制因素，如蛋白质伴侣协作来执行这些功能。此外，基因的缺失或突变可用于测试特定的蛋白质或蛋白质亚基的贡献，这个过程。在这篇文章中，我们研究的贡献HSP104的蛋白质disaggregase的^13，被称为折叠系统⁵与Hsp40/70/nucleotide的交换因子（NEF）的合作伙伴，蛋白质折叠，来验证这种方法。

引言

在人类神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和亨廷顿病已与蛋白质错误折叠和聚合^10。细胞采用分子伴侣防止动能捕获细胞的蛋白质错误折叠的无效结构^6。分子伴侣参与细胞内的复杂的相互作用网络，但它是不完全的理解这些相互作​​用的总和是如何有助于有机体proteostasis。负责为广大胞浆蛋白折叠的主要伴侣之一是70 kD的热休克蛋白（HSP70）家族^19。它已经表明，在酵母中的Hsp70减少损失新生的异源表达的平板荧光灯能够折叠和重折叠，鸟氨酸transcarbamoylase，内源性蛋白⁷ 在体内 ^18。能够分析近实时分辨率折叠方便了解更多的细胞因子续ribute这HSP70依赖的过程。此外，可能不完全依赖于这些蛋白质有助于折叠/折叠反应，所以实验必须敏感，可以探测动力学和效率的大，小的变化。

酵母细胞disaggregase，HSP104，在修复聚合错误折叠的蛋白质中起着至关重要的作用。 Hsp104同源物已确定在真菌和植物，这个家庭似乎是在后生动物缺席。已经提出了其他分子伴侣，如HSP110家族的一些已知的Hsp104在哺乳动物中的活动¹⁶执行。 HSP104为AAA +，六聚体蛋白复合物的功能在改造蛋白质聚集酵母，折叠和维修^13。 HSP104，沿与Hsp70的酵母，SSA1，和酵母HSP40，Ydj1为，是必需的恢复变性平板荧光灯在酵母细胞中^5星，8。小的热休克蛋白，HSP26，也被证明是地磁红的Hsp104介导分解FFL ^2。

FFL是一个双结构域的蛋白结合的活性位点的构象变化，需要ATP和氧，脱羧后的衬底荧光素释放氧化萤光素，二氧化碳（CO _2），腺苷一磷酸（AMP），和光^11，在基板^9，3。市售FFL基板，D-荧光素，使用光度计^15，可以检测到550-570纳米之间的光发射的结果。 FFL是极其敏感变性化学或热处理和聚合后迅速展开。当暴露在温度39-45°C之间的，FFL可逆展开和灭活^12。相比之下，GFP及其衍生物具有很高的耐应力¹⁴蛋白质变性。因此，这两种蛋白质的融合使得FFL充当实验能够瞄准功能ĝ的不稳定部分FP细胞内的存款，可以用荧光显微镜可视化人口和单细胞水平。酶法测定半自动化加上自动显微镜的多模板读数器中的应用允许前所未有的复性反应的动力学和产量的同时评估。此外，轻便的分子遗传学模型真核生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）允许的蛋白质的质量控制网络的机会，发现为基础的方法，以确定新的播放器，促进细胞的应激反应和proteostasis两个精确操纵。

在这项研究中，野生型（WT）和的HSP104缺失株FFL-GFP表达热休克蛋白变性。 FFL-GFP复性进行监测，通过酶法测定和代理读数显微镜维修表达蛋白质组过一个恢复时间当然。当野生型细胞相比，我们表明êHSP104折叠FFL-GFP突变株〜60％的效率较低，支持以前的研究结果，建立HSP104的激活变性FFL ^2的一个角色。

研究方案

1。含FFL-GFP质粒菌株建设

在这项研究中， 酿酒酵母菌株BY4741（MAT 一个 his3Δ1，leu2Δ0，met15Δ0，ura3Δ0）一起使用从酵母基因敲除集合（打开生物系统/ Thermo Scientific的）一个的HSP104缺失菌株。删除Hsp104特异性抗体免疫印迹分析证实。

FFL-GFP表达p426MET25 FFL-GFP，构建一个基于LEU2源质粒格洛弗实验室获得多伦多大学¹⁷索取请求提交后。 MET25甲硫氨酸阻遏的启动子控制的FFL-GFP质粒的融合蛋白的表达。质粒转化到每一株被改编从Gietz 等使用的协议。人 ，1995年：

1. 离心25毫升Ø f日志期细胞50毫升锥形管2分钟，在4,400 rpm的转速下，用500微升的双蒸H ₂ 0（DDH ₂ O），弃上清。
2. 将细胞重新悬浮在250μl的TE /醋酸锂（的Tris-HCl的10mM，pH值= 7.5，1mM EDTA的溶液，0.1M乙酸锂）。搅拌20分钟，在30°C孵育没有。
3. 50μl的感受态细胞转移到新的试管，以及载体DNA，用5毫升（50微克）和5μl（0.1-5微克）质粒DNA。添加300μl的PEG / TE /醋酸锂（相同的TE /醋酸锂加40％的聚乙二醇），此混合物中加入另外的30分钟，在30℃下孵育。
4. 1/10体积（体积/体积）的DMSO（36微升）加入到该混合物中，并在42℃下热休克6分钟。
5. 混合物以6,000 rpm离心30秒，除去上清液。细胞重悬在100μl的无菌DDH _{2 O}和板细胞在缺乏尿嘧啶（SC-URA）的合成完整的媒体。

2。 FFL-GFP诱导

NT“> FFL-GFP诱导，一旦细胞对数生长期，所以大部分的蛋白质，热休克前新，以避免随着时间的推移，由于衰老相关的细胞不足蛋白质，身患汇总。

1. 第1天：孵育细胞在5毫升SC-市建局在30°C旋转O / N。
2. 第2天：测量外径₆₀₀和5 SC-URA外径_600〜0.2毫升接种新鲜文化。
3. 培养与旋转30°C，直到他们达到数生长期外径_{600〜0.8-1.0。}
4. 3分钟后，倾去上清液，重悬细胞沉淀在15毫升锥形管，在4,400 rpm转速离心细胞DDH ₂ 0 500微升;离心管中的传输解决方案。
5. 在6000转离心，弃上清。
6. 重悬细胞SC-URA-MET在5毫升。细胞应在30℃下孵育1小时，在这样的介质旋转
7. 离心机细胞和重复洗的DDH ₂ 0丢弃上清。
8. Resuspe第二细胞在5毫升SC-市建局媒体含有100微克/毫升，放线菌酮抑制蛋白的表达，并立即进行步骤3。

3。酶法FFL-GFP恢复含量

此法是一种定量的方法来确定在一个群体中的活性酶的水平。

1. 这个实验的准备工作：
   1. 测量每个样品外径_600。
   2. 准备所需的必要量的D-荧光素的基础上的样本数量和所需数量的复加油管约1200微升。 D-荧光素的终浓度为〜23微克每100μl的细胞。最初，它是溶解在水中的储备液浓度为7.5毫克/毫升，实验前稀释至455微克/毫升在SC。在图2中，重复三次，对每个样品进行了分析，得到的共2.4毫升D-荧光素被使用。
   3. 程序酶标仪的闪光LUMI释光测定（BioTek的GEN5“发光闪光含量与注射”改编自其他工具按照制造商的说明）
      1. 至30℃的设定温度
      2. 设置钢板读者添加D-荧光素，摇匀，并读取每个单独。
      3. 阅读发光（端点读取积分时间，5秒，180灵敏​​度电平）
      4. 恢复检测每个读数之间摇5分钟，延时20分钟，摇5分钟。
      5. 免除50微升的D-荧光素从一个喷油器。
2. 后立即测量的细胞中添加介质中放线菌酮，阻止蛋白质的合成预热休克发光的。
   1. 每个样品100微升细胞转移成固体白色96孔板中所需的重复数。
   2. 应包括控制水的空白，并含有空载体的细胞。
   3. 开始读与SPE上面列出的cifications。
3. 变性，的平板荧光灯-GFP FFL部分，在一个玻璃培养管中孵育5毫升培养在42℃下摇动25分钟。
4. 恢复化验发光读数立即启动细胞去除后，从孵化器，这是时间点零。测量发光上述相同的第一时间点和每30分钟90分钟。
5. 将正常化样品预热休克发光值已作调整的基础上外径_600（外径₆₀₀划分的预热冲击值）。

4。荧光显微镜

此法是一种半定量的方法来确定随着时间的推移在一个群体中的细胞聚集体溶解。

1. 感应第2节中所描述的相同，步骤1-8的协议。
2. 同一时间点作为上述（ 第3项，第4步 ），但对于麦克风roscopy收集1毫升预热休克细胞，每个恢复的时间点，并孵育样品，于30℃培养管旋转。
3. 可视化：
   1. 1毫升的细胞以6,000 rpm离心30秒，除去上清液。
   2. 重悬细胞沉淀中加入2μl双蒸₂ O。
   3. 混合2微升的细胞加2微升2％的低熔融琼脂糖幻灯片上，加盖玻片。为了获得一个单一的平面的细胞轻轻地按压手指在盖玻片的中心和旋转，直到盖玻片难以移动。
   4. 细胞可视化使用100X油目标的荧光显微镜使用DIC可视化细胞和FITC过滤的可视化绿色荧光。
   5. 每个菌株在各时间点的定量，以多张图片。图片字段应该包含〜15-30细胞实验后定量分析。
   6. 要包含聚集的细胞百分比计算，算上50-100细胞总数除以包含聚集的细胞。

5。单细胞显微镜

使用这种方法时，按照随着时间的推移在单个细胞中的单个聚集体的增溶。

1. 诱导FFL-GFP的表达， 第2节中所描述的步骤1-8。
2. 热休克后，离心细胞15毫升锥形管，在4,400 rpm的转速为2分钟。
3. 洗涤细胞用500μl的水重悬在20微升双蒸₂ O。
4. 对于每个应变，切出部分的SC-市建局的琼脂平板和一个5x5毫米使用表面接触培养皿，吸管4μL枪头，琼脂表面的细胞和周围蔓延。让我们站在〜1分钟。
5. 使用镊子，将琼脂立方体正面朝下放在一个〜55毫米的玻璃底菜0号，轻轻按下。
6. 可视化：
   1. 教I-III离子4。
   2. 设置2-4重点每一株取决于密度的文化坐标。
   3. 设置适当的范围（ - / +与0.5-1.0微米的切片厚度15微米）90分钟内每5分钟一个Z堆栈相机拍照。

结果

酵母是依赖于disaggregase，HSP104高效地热变性的蛋白质复性。 FFL-GFP的活动进行了监测热休克25分钟后，使用发光闪光检测图1。这个自动化的测定如图2所示的结果揭示了超过90分钟，最终导致了一个野生型细胞> 80％恢复的活动逐步增加。该hsp104Δ应变恢复原有活性的19％，在同一时间帧。此外，初始失活程度远远高于伴侣突变株（26％活动在WT和11％hsp104Δ），...

讨论

在这篇文章中的模型蛋白FFL-GFP是用来显示该的酵母disaggregase，HSP104有助于蛋白质重新溶解和维修。的酶活分析和显微镜差异讯问的相同的底物蛋白的状态来确定的复性效率和产量。酶的恢复检测的结果表明，不仅是在的突变株hsp104D效率低下的最大恢复，但在突变株（ 图2）展开应力的初始幅度更大。分析还显示，虽然出现hsp104D细胞试图修复，他们无法重新折叠蛋白尽快...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484