İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Özet

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif eder In vivo protein katlanması Saccharomyces cerevisiae. Bir model ısıyla denatüre edilmiş proteinin yeniden katlanması, bu tepkin madde kullanılarak floresan mikroskop ve protein kalite kontrol proteostasis ağ bileşenlerinin rollerini araştırmak için bir enzimatik deneyi ile aynı anda kontrol edilebilir.

Özet

Protein katlanması / biyogenezi kombine süreçler olarak tanımlanan Proteostasis, refolding / onarım ve bozulması, zararlı sonuçlara ¹ önlemek için korunması gerekir hassas bir hücresel dengedir. Bu dengeyi bozabilir iç ve dış faktörler protein toplama, toksisite ve hücre ölümüne yol açabilir. İnsanlarda bu, Huntington, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıkların ¹⁰ ile ilişkili semptomlar için önemli bir katkıda bulunan bir faktördür. Bu proteostasis bakım katılan proteinler bu zayıflatan hastalıklar için tedavi geliştirmek amacıyla tespit edilmesi bu nedenle önemlidir. Bu makale yeşil flüoresan protein (FFL-GFP) erimiş modeli protein ateşböceği lusiferaz kullanarak yakın gerçek zamanlı çözünürlükte in vivo protein katlanması izleme teknikleri anlatılmaktadır. OFF kısmı strese bağlı m son derece hassas olduğu için OFF-GFP eşsiz bir model kimerik proteindirenzim ¹² inaktive isfolding ve toplama,. Lusiferaz aktivitesi, bir enzimatik deney kullanılarak izlenir, ve GFP kısmı otomatik mikroskopi kullanılarak çözülebilir ya da toplu OFF görüntülenmesi için bir yöntem temin edilmektedir. Bu birleştiğinde yöntemler refolding ve stres sonra enzimin fonksiyonel reaktivasyonu hem analiz etmek için iki paralel ve teknik olarak bağımsız yaklaşımlar içermektedir. Faaliyet kurtarma doğrudan daha iyi protein chaperones gibi protein kalite kontrol faktörler bu işlevleri gerçekleştirmek için işbirliği nasıl anlamak için ayrıştırma ve yeniden çözünmüş kinetiği ile ilişkili olabilir. Buna ek olarak, gen silme ya da mutasyon bu işlem için özel protein veya protein alt birimlerinin katılım test etmek için de kullanılabilir. Bu yazıda bu yaklaşım doğrulamak için protein refolding için, sistemi ⁵ refolding Hsp40/70/nucleotide değişim faktörü (NEF) ile ortak bilinen protein disaggregase Hsp104 ^13, katkıları inceleyin.

Giriş

İnsanlarda Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıklar yanlış katlanması ve protein agregasyonu ¹⁰ ile bağlantılı olmuştur. Hücreler katlanan aktif yapıları ⁶ içine hücresel proteinlerin kinetik yakalama önlemek için moleküler şaperonlar kullanır. Chaperones hücre içinde karmaşık etkileşim ağları katılmak, ancak tamamen bu etkileşimlerin toplamı organizma proteostasis nasıl katkıda anlaşılamamıştır. Sitozolik protein katlanması çoğunluğu sorumlu başlıca chaperones biri 70 kD ısı şok proteini (Hsp70) aile ^19'dur. Bu, gösterilmiştir ki, Hsp70 azalır maya kaybı olgunlaşmamış heterolog bir şekilde eksprese OFF katlamak ve in vivo ^{18, 7,} endojen proteinin, ornitin transcarbamoylase, yeniden kapatmak için yeteneği. Yakın-gerçek zamanlı çözünürlüğü ile katlama analiz yeteneği anlaşılmasını kolaylaştırmak nasıl ek hücresel faktörler devamBu Hsp70 bağımlı işlemine destek olmaktır. Buna ek olarak, katlama / reaksiyonlar refolding bu katkı proteinler tamamen bağımlı olmayabilir, bu nedenle testleri kinetik ve verimlilik büyük ve küçük değişiklikler hem saptamak için yeterli olmalıdır.

Maya hücre disaggregase, Hsp104, toplu katlanan proteinleri tamir hayati bir rol oynar. Hsp104 homologlar mantar ve bitki tespit edilmiş olmasına rağmen, bu aile metazoans yok gibi görünmektedir. Bu tür Hsp110 ailesinin gibi diğer chaperones memeliler ¹⁶ bilinen Hsp104 faaliyetlerin bazı gerçekleştirmek ileri sürülmüştür. Hsp104 bir AAA +, heksamerik protein kompleksi olduğunu değişiklik protein agrega için maya fonksiyonları, refolding ve onarım ¹³ katkıda. Hsp70 maya, Ssa1, ve maya Hsp40, Ydj1 birlikte Hsp104, maya hücreleri ^{5, 8} denatüre OFF geri kazanımı için gereklidir. Küçük ısı şok proteini, Hsp26, aynı zamanda requi olduğu gösterilmiştirOFF ² Hsp104 aracılı ayrıştırma için kırmızı.

Ffl alt tabaka, aktif sahada lusiferin ve ATP ve oksijen, decarboxylates gerektiren bir konformasyonel değişimin ardından bağlanan bir iki-domenli bir proteindir oxyluciferin, karbon dioksit _(CO2), adenozin monofosfat (AMP) ve ışık ^11, serbest substrat ^{9, 3.} Ticari olarak temin edilebilen OFF substrat, D-luciferase bir luminometrede ¹⁵ kullanılarak tespit edilebilir 550-570 nm arasında ışık yayılması ile sonuçlanır. OFF açılımı üzerine kimyasal veya ısıl işlemler ve hızla agrega gelen denatürasyon için zarif duyarlıdır. 39-45 arasında sıcaklıklara maruz kaldığında ° C OFF geri dönüşümlü gelişeceğini ve inaktif ¹² olduğunu. Bunun tersine GFP ve türevleri gerilme ¹⁴ açılımı proteini için son derece dayanıklıdır. Bu nedenle, bu iki proteinin füzyon fonksiyonel G hedefleme yeteneğine sahip bir deneysel olarak oynak parçası olarak işlev sağlar OFFFP nüfus ve tek bir hücre düzeyde hem de floresan mikroskobu kullanarak görüntülenebilir mevduat hücre içi. Otomatik mikroskobu ile birleştiğinde bir yarı-otomatik modlu plaka okuyucu enzimatik test uygulanması kinetik ve reaksiyon refolding getirisi görülmemiş eş zamanlı değerlendirilmesi sağlar. Buna ek olarak, ökaryot modeli, Saccharomyces cerevisiae kolay moleküler genetik hassas protein kalitesi kontrol ağ manipülasyon ve hücresel stres tepkisi ve proteostasis katkıda bulunan yeni bir oyuncu tespit etmek Buluşa dayalı yaklaşımlar için fırsat hem de sağlar.

Bu çalışmada, III-GFP ifade vahşi tip (WT) ve HSP104 silme suşları protein denatüre ısı şokuna tabi tutulur. OFF-GFP refolding bir iyileşme süresi boyunca ifade proteom tamiri için bir proxy okuma olarak bir enzimatik tahlil ve mikroskopi hem aracılığıyla izlenir. WT hücrelere karşılaştırıldığında, biz th göstermekE Hsp104 silme gerginlik denatüre OFF ² reaktivasyonu içinde Hsp104 için bir rol kurulması önceki bulguları destekleyen, FFL-GFP refolding de ~% 60 daha az verimlidir.

Protokol

1. Plazmid OFF-GFP İçeren Suşlarının İnşaatı

Bu çalışma için, Saccharomyces cerevisiae suşu BY4741 (MAT bir, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) maya nakavt toplama (Açık Biyosistem / Thermo Scientific) bir HSP104 silme suşu ile birlikte kullanılmıştır. Silme Western blot analizi için bir Hsp104 spesifik antikor kullanılarak doğrulandı.

OFF-GFP yazarlara talep üzerine Toronto ¹⁷ Üniversitesi ve elde de Glover laboratuvar elde edilen plazmid bir LEU2-tabanlı kaynak yapılmış, p426MET25-OFF-GFP ifade edildi. III-gfp plazmit füzyon proteininin ifadesi doğal arttırıcıları olan MET25 metiyonin bastırılabilir promotörü tarafından kontrol edilir. Plazmid Gietz ve arkadaşları uyarlanmış bir protokol kullanılarak, her bir suş dönüştürüldü. arkadaşları, 1995:

1. 25 ml o Santrifüj 2 dakika 4.400 rpm'de 50 ml konik tüp f log fazı hücreleri, çift distile H ₂ 0 (GKD ₂ O) 500 ul ile yıkayın ve yüzen kısım atın.
2. TE / LiAc (Tris-HCI 10 mM, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 M lityum asetat) ve 250 ul içinde süspanse hücreleri. 20 dakika boyunca karıştırmadan 30 ° C'de inkübe edin.
3. Taşıyıcı DNA 5 ml (50 mg) ve plazmid DNA 5 ul (0.1-5 mg) ile birlikte, yeni bir tüpe yetkili hücreleri 50 ul aktarın. PEG / TE / LiAc (TE / LiAc artı% 40 polietilen glikol gibi) bu karışıma 300 ul ekleyin ve ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 30 inkübe hücreleri.
4. 6 dakika boyunca 42 de bu karışım ve ısı şoku ° C ila 1/10 hacim (v / v) DMSO (36 ul) ilave edilir.
5. 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm karışımı santrifüj. Urasil (SC-URA) eksik sentetik tam medya üzerine steril GKD ₂ 0 ve plaka hücreleri 100 ul hücreleri tekrar süspansiyon.

2. OFF-GFP indüksiyon

önce ısı şok proteini çoğunluğu yeni terminal yaşlanmayla ilişkili hücresel yetersizlikler nedeniyle zaman içinde toplanmış olan proteinler önlemek için yapılır, böylece hücrelerin log fazı bir kez nt "> III-GFP indüklenir.

1. Gün 1: 30 SC-Ura 5 ml inkübe hücreleri ° C döner O / N
2. 2. Gün: ölçün OD ₆₀₀ ve SC-URA OD ₆₀₀ ~ 0.2 5 ml inokülasyon taze kültür.
3. Onlar log fazı OD ₆₀₀ ~ 0.8-1.0 ulaşmak ° C kadar 30 rotasyon ile kültür inkübe edin.
4. GKD ₂ 0 500 ul 3 dakika, süzün yüzen kısım ve tekrar süspansiyon hücre pelet için 4,400 rpm'de 15 ml konik tüpler hücreleri Santrifüj, bir mikrosantrifüj tüp transferi çözüm.
5. 6.000 rpm'de santrifüj ve yüzen kısım atın.
6. SC-URA-MET 5 ml süspansiyon hücreleri. Hücreler, 30 ° C'de 1 saat boyunca bu ortam içinde dönen inkübe edilmelidir
7. Santrifüj hücreleri ve tekrar GKD ₂ 0 olarak yıkama ve yüzen kısım atın.
8. Resuspe100 ug / protein ekspresyonu inhibe ettiği ve Adım 3 hemen devam etmeye sikloheksimid ml içeren 5 ml SC-URA ortam nd hücreleri.

3. Enzimatik OFF-GFP Kurtarma Testi

Bu testte bir popülasyonda aktif enzim düzeylerini belirlemek için nicel bir yaklaşımdır.

1. Bu deney için hazırlanması:
   1. Her numune için OD ₆₀₀ ölçün.
   2. D-luciferase gerekli miktarda hazırlayın örneklerin sayısına göre ve kopya sayısı artı boru için yaklaşık olarak 1.200 ul istenilen gerekli. D-luciferase son konsantrasyon hücrelerinin 100 ul başına ~ 23 mikrogram olduğunu. Başlangıçta bu 7.5 mg / ml 'lik bir stok çözeltisi konsantrasyonda su içinde çözülür ve önceden deneme için 455 ug / SC ml' ye seyreltildi. Her bir örnek D-luciferase kullanılan 2.4 ml toplam sonuçlanan analiz edildi için Şekil 2'de, üç çoğaltır.
   3. Flaş lumi Programı plaka okuyuculüminesans yöntemi (BioTek Gen5 "Enjeksiyon ile Lüminesans Flaş Testi" uyarlanan; diğer enstrümanlar üreticinin talimatlarına için)
      1. 30 ° C sıcaklık ayarı
      2. , D-luciferase ekleyin sallamak, ve tek tek her iyi okumak için plaka okuyucu ayarlayın.
      3. Lüminesans okuyun (nokta okuma, 5 saniye entegrasyon süresi, 180 duyarlılık düzeyi)
      4. 5 dakika boyunca her bir okuma Karıştırılmış arasında iyileşme testi için, 20 dakika gecikme ve ilave 5 dakika karıştırın.
      5. Bir enjektörün D-luciferase 50 ul koyun.
2. Hücreler protein sentezi durdurmak için sikloheksimid içeren medya eklendikten sonra ön ısıtma-şok lüminesans hemen ölçülür.
   1. Sağlam bir beyaz 96 plaka içine çoğaltır istenilen sayıda her bir örnek için hücrelerin 100 ul aktarın.
   2. Kontroller bir su boş ve boş bir vektör içeren hücreleri içermelidir.
   3. SPE ile okuma başlarcifications Yukarıda listelenen.
3. III-GFP OFF yarımı denatüre etmek için, 42 yaşında bir camdan yapılmış bir kültür tüp içinde 5 ml kültür ° C'de inkübe edin, 25 dakika boyunca sallayın.
4. Hücreler zaman noktası sıfırdır inkübatör, kaldırılır sonra Kurtarma test lüminesans okuma hemen başlar. İlk zaman noktası ve 90 dakika boyunca her 30 dakika için yukarıda tarif edildiği gibi aynı ölçüde lüminesans.
5. OD ₆₀₀ (OD ₆₀₀ ile ön ısıtma-şok değerleri bölmek) göre ayarlanır olan ön ısıtma-şok lüminesans değerlere örnekleri normalleştirmek.

4. Floresan Mikroskopi

Bu deney bir hücre popülasyonunda zamanla agrega çözünürleştirme belirlemek için bir yarı-nicel bir yöntemdir.

1. İndüksiyon, Bölüm 2'de tarif edildiği gibi, aynı protokol 1-8 adımlar.
2. Aynı zaman noktalarında (Bölüm 3, Adım 4) yukarıda tarif edildiği gibi alınmıştır, ancak mikrofon içinroscopy 1 ön ısıtma-şok da hücre ml ve her iyileşme süresi noktası ve ° C kültür tüp içinde 30 dönen inkübe örnekleri toplamak.
3. Görselleştirme:
   1. 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm hücre 1 ml santrifüj.
   2. GKD ₂ O. 2 ul tekrar süspansiyon hücre pelet
   3. Pil, slayt üzerinde% 2 düşük erime agaroz 2 ul 2 ul karıştırın ve bir kapak kayma ekleyin. Hücreleri tek bir düzlem elde etmek için hafifçe kapak kayma ortasındaki parmak bastırın ve kapak kayma taşımak zor kadar döndürün.
   4. Hücreler floresan mikroskop 100X yağ objektif kullanarak raporlarının yer; GFP floresan görselleştirmek için hücreleri ve FITC filtresi görselleştirmek için DIC kullanın.
   5. Kantitatif için her noktada her bir suş için birden fazla fotoğraf çekmek. Resimler için alanları nicel sonrası deneysel analizi için ~ 15-30 hücreleri içermelidir.
   6. Agrega içeren hücrelerin yüzdesi hesaplamak için, 50 saymak-100 Hücreleri toplam ve agrega içeren hücrelerin sayısı bölün.

5. Tek Hücre Mikroskopi

Bu yöntem, zaman içinde tek bir hücrede bireysel agregaların çözündürme takip etmek için kullanılır.

1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi III-GFP ekspresyonunu, 1-8 adımlar.
2. Sonra ısı-şok, 2 dakika 4.400 rpm'de 15 ml konik tüp santrifüj hücreleri.
3. GKD ₂ O. 20 ul su ve tekrar süspansiyon 500 ul hücreleri yıkayın
4. Her bir suş için, bir SC-URA agar plaka bir 5x5 mm bölümünü kesip Petri kabı, pipet ile agar yüzeyi etrafında hücreleri ve yayılma ul pipet 4 ile temas olan yüzey kullanarak. ~ 1 dakika bekletin.
5. Bir ~ 55 mm cam alt çanak No 0 yüzü aşağı agar küp bölümü yerleştirin ve hafifçe bastırın için cımbız kullanın.
6. Görselleştirme:
   1. Tarikatı i-iii bakiyon 4.
   2. Set kültür yoğunluğuna bağlı olarak her bir suş için 2-4 odak noktaları için koordine eder.
   3. (- Bir 0.5-1.0 mikron dilim kalınlığında / + 15 mikron) bir 90 dakika süreyle her 5 dk uygun yelpazesi ile bir Z-yığını ile fotoğraf çekmek için kamera ayarlayın.

Sonuçlar

Maya disaggregase bağlıdır, Hsp104 verimli ısı denatüre proteinlerin yeniden kapatmak için. OFF-GFP faaliyeti bir parlaklık flaş testi Şekil 1 kullanarak, bir 25 dakika ısı şok sonrası izlenmiştir. Şekil 2'de gösterilen bu otomatik test sonuçları, sonuçta WT hücrelerinde>% 80 düzelme sağladı 90 dakika boyunca aktivitesinde kademeli bir artış saptandı. Hsp104Δ gerginlik aynı zaman dilimi içinde, orijinal aktivitesinin% 19 iyileşti. Ayrıca, ...

Tartışmalar

Bu yazıda modeli protein FFL-GFP maya disaggregase, Hsp104 protein yeniden-solübilizasyon ve onarım katkıda göstermek için kullanılmıştır. Enzimatik deneyler ve diferansiyel olarak mikroskobik yeniden katlama etkinliği ve verimi belirlemek için, aynı alt-tabaka proteini durumunu sorguya. Enzimatik kurtarma testlerinin sonuçları, verimsiz hsp104D mutant soyu içinde maksimum iyileşme değil sadece olduğunu göstermektedir, ancak açılımı stres başlangıç ​​büyüklüğü mutant suşu

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Synergy MX Microplate Reader	BioTek
Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope	Olympus, Tokyo Japan
Lumitrac 200 white 96-well plates	USA Scientific
SlideBook 5.0 digital microscopy software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA
Equipment
Tris Base	Fisher	BP152-1
(LiAc) Lithium Acetate	Sigma	L6883
PEG (polyethelene glycol)	Fisher	BP233-1
EDTA	Fisher	BP120-1
DMSO	Malinckrodt	4948
SC	Sunrise	1300-030
SC-URA	Sunrise	1306-030
cycloheximide	Acros Organics	357420050
D-luciferin	Sigma	L9504
low melt agarose	NuSieve	50082
immersion oil	Cargille	16484