JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.

Abstract

تم التعرف على الجين MGM101 قبل 20 عاما لدوره في الحفاظ على الحمض النووي. واشارت دراسات عدة مجموعات من أن البروتين Mgm101 وتشارك في إصلاح تهجيني من الحمض النووي. وأشارت التحقيقات الأخيرة التي Mgm101 تتعلق Rad52 من نوع إعادة التركيب عائلة البروتين. هذه البروتينات تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبير وتعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. ومع ذلك، فقد أعاقت توصيف Mgm101 من صعوبة في إنتاج البروتين المؤتلف. هنا، يوصف إجراء موثوق بها لإعداد المؤتلف Mgm101. المالتوز البروتين ملزمة (ب ب) الموسومة Mgm101 يتم التعبير الأول في الإشريكية القولونية. يتم تنقيته من البروتين الانصهار في البداية من قبل أميلوز تقارب اللوني. بعد إطلاق سراحه من قبل انشقاق بروتين، يتم فصل Mgm101 من MBP بواسطة الموجبة اللوني الصرف. يتم الحصول على Monodispersed Mgm101 ثمحسب حجم الاستبعاد اللوني. العائد من ~ 0.87 ملغ من Mgm101 للتر الواحد من ثقافة البكتيرية ويمكن الحصول بشكل روتيني. وMgm101 المؤتلف ديه الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي. يتم استخدام عينات معدة بنجاح لالبيوكيميائية والهيكلية واحد الجسيمات تحليلات صورة Mgm101. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات الحمض النووي ملزم بلازميدة قليلة القسيمات الكبيرة الأخرى التي يمكن أن تتجمع وسامة للخلايا البكتيرية.

Introduction

إعادة التركيب مثلي المهم لإصلاح مزدوج الجديلة فواصل (DSBs) وinterstrand crosslinks، وباستعادة تكرار الحمض النووي من تكرار الشوك المنهارة 1. في إعادة التركيب مثلي التقليدية، يتم تحفيز رد الفعل المركزي من قبل recombinases التي تعتمد على ATP بما في ذلك RECA في بدائيات النوى، وRad51 وDmc1 في حقيقيات النوى 1-3. هذه recombinases تشكيل خيوط البروتين النووي على ssDNA، التي تعتبر ضرورية للبدء في البحث عن التماثل وغزو حبلا ضمن قوالب الحمض النووي المزدوجة (الشكل 1، لوحة اليسار) 4-7. بالإضافة إلى مخطط التقليدية، ويمكن إعادة التركيب مثلي أيضا أن تأخذ مكان بطريقة RecA/Rad51-independent (الشكل 1، لوحة على اليمين). على سبيل المثال، يمكن أن الخميرة Rad52 وRad59 البروتينات تحفز بشكل مباشر على الصلب من فروع ssDNA التكميلية التي يتعرض لها من قبل resectioning من فواصل dsDNA. هذه العملية إعادة التركيب، والمعروفة باسم الغناءجنيه حبلا الصلب، وعموما لا تنطوي على الاقتران مثلي مع القوالب dsDNA. بعد الصلب، يتم إزالة ذيول مغاير من قبل exonucleases وو تربط النكات لاستعادة 8-10 استمرارية الجينوم. وغالبا ما يترافق إصلاح من قبل آلية الصلب حبلا واحد عن طريق الحذف من تسلسل الجينوم بين المناطق المتكررة مباشرة.

Rad52 ينتمي إلى مجموعة متنوعة من البروتينات إعادة التركيب التي هي على نطاق واسع بين البكتيريا 11. وتعرف هذه البروتينات أيضا باسم ضفيرة واحدة البروتينات التليين (SSAPs)، على أساس نشاطهم في تعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. أفضل SSAPs البكتيريا تتميز هي Redβ وإيرف من البكتيريا λ وP22، مصحح من RAC طليعة العاثية والبروتين ساك من فج lactococcal ul36. وتتميز هيكليا SSAPs من قبل أضعاف β-β-β-α نموذجي، على الرغم من التشابه هو undetect تقريباقادرة في تسلسل الابتدائي. أنهم جميعا شكل حلقات هومو بلازميدة قليلة القسيمات كبير من 10-14 أضعاف التناظر في المختبر 12-14. الآثار الوظيفية لهذه المنظمة مميزة مرتبة أعلى الهيكلية ليست مفهومة جيدا.

ونحن مهتمون في فهم آلية إعادة التركيب مثلي في الجينوم الميتوكوندريا. حددنا سابقا الجين MGM101 التي لا غنى عنها للحفاظ على و mtDNA في خميرة الخباز 15. تم العثور MGM101 في وقت لاحق أن تكون مرتبطة مع nucleoids الميتوكوندريا ومطلوب من أجل التسامح و mtDNA من الحمض النووي للعوامل المضرة 16. ومع ذلك، فقد تم عقد دراسة Mgm101 مرة أخرى في العقد الماضي من قبل صعوبة لإنتاج Mgm101 المؤتلف. لقد نجحنا مؤخرا في إنتاج Mgm101 قابل للذوبان في كميات كبيرة من E. القولونية باستخدام استراتيجية MBP الانصهار. وقد مكن هذا لنا لإثبات أن Mgm101 سهمأوجه التشابه البيوكيميائية والهيكلية مع Rad52-عائلة من البروتينات 17،18. في هذا التقرير، وصفت إجراء تنقية ثلاث خطوات، والتي تنتج Mgm101for التحليلات البيوكيميائية والهيكلية متجانس (الشكل 2).

Protocol

وقد أظهرت دراسات سابقة أن أول محطة الأمينية 22 مخلفات Mgm101 يتم المشقوق بعد الاستيراد في الميتوكوندريا 19. للتعبير في الإشريكية القولونية، يتم تضخيمه MGM101 إطار القراءة المفتوح تفتقر إلى الكودونات أول 22 بواسطة PCR وضعت المصب من تسلسل ذكر ترميز البروتين ملزمة المالتوز (ب ب) في نسخة معدلة من ناقلات التعبير pMAL-C2E. هذا يولد الانصهار MBP-Mgm101 مع رابط موقع يحتوي على الانقسام لالبروتيني PreScission (الشكل 3). البلازميد هي التي شيدت أول من خلال تحديد E. transformants القولونية دون IPTG وXgal اختيار أزرق / أبيض. ثم يتم إدخال البلازميد الناتج pMAL-C2E-MGM101 في E. كولاي سلالة BL21-CodonPlus (DE3)-ريلاينس اندستريز من خلال تحديد الأمبيسلين والمستعمرات مقاومة الكلورامفينيكول.

1. التعبير، والاستقراء، تحلل الخليوي وأنا الدناز العلاج

  1. شركة النفط الوطنية العراقيةulate transformants الطازجة في 10 مل من المتوسط ​​LB (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ مستخلص الخميرة، 1٪ كلوريد الصوديوم) تستكمل مع الجلوكوز (0.2٪)، الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (50 ميكروغرام / مل). احتضان عند 37 درجة CO / N مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  2. تلقيح preculture مل 10 إلى 2 ليتر من المتوسط ​​LB تستكمل على النحو الوارد أعلاه. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الهز حتى تصل إلى 0.5 OD 600.
  3. لحث على التعبير عن بروتين الانصهار MBP-Mgm101 بإضافة الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في تركيز النهائي من 0.3 ملم. تنمو الخلايا مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي باستخدام بيكمان JA-10 الدوار (5،500 x ج، 4 ° C، 10 دقيقة). بعد تجاهل طاف، resuspend وبيليه خلية في 30 مل من تحلل العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (25 leupeptin ميكرومتر، ميكرومتر 1 pepstatin A و 1 ملي PMSF).
  5. يصوتن تعليق الخلية على الجليد لمدة 20ثانية باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية (نظم الحرارة؛ نموذج W-385) في دورة العمل 50٪، والسماح لتبرد على الجليد لمدة 30 ثانية، وكرر 2X.
  6. إضافة 1 مل من 1 الأسهم الدناز في 2 ملغ / مل. صخرة المحللة الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  7. ضبط كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 500 مم.
  8. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

2. تنقية أميلوز مع تقارب اللوني

  1. تتوازن 1.5 مل من راتنج أميلوز (50٪ الطين) في تحلل العازلة. إضافة الراتنج أميلوز معايرتها إلى المحللة الخلية. صخرة بلطف عند 4 درجة CO / N.
  2. تحميل مزيج المحللة الراتنج على عمود اللوني فندق Econo عمود تركيبها في غرفة باردة. السماح للبروتينات غير منضم لتمرير العمود عن طريق الجاذبية.
  3. غسل الراتنج أميلوز مع 300 مل من غسل العازلة الأول (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4؛ 400 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF).
  4. تكرار غسل مع 150 مل من غسل العازلة الثاني (20 ملي TRIS، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF).
  5. إضافة 5 مل من شطف العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF، 10 ملي المالتوز) إلى العمود، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وجمع شطافة وكرر لأكثر من مرة.
  6. الجمع بين eluates، وتحديد العائد ونقاء MBP-Mgm101 عن طريق تحميل قسامة من شطافة على هلام SDS-PAGE تليها coomassie تلطيخ (الشكل 4).

3. PreScission الشق البروتيني والموجبة تبادل اللوني

  1. إضافة 50 وحدة من الأنزيم البروتيني PreScission إلى شطافة MBP-Mgm101. أداء انشقاق في 4 درجات CO / N والسماح لها بمواصلة خلال غسيل الكلى ضد العازلة غسيل الكلى (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم DTT؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF)
  2. تحقق من كفاءة الانقسام على هلام SDS-PAGE (الشكل 5A).
  3. تحميل المشقوق MBP-Mgm101 بواسطة حقن متعددةالأيونات على الحيوية البسيطة مقياس ماكرو الإعدادية عالية S خرطوشة متصلا DuoFlow بيولوجي نظام FPLC بيو راد.
  4. بدء اللوني تبادل الأيونات الموجبة عن طريق تطبيق التدرج خطوة الملح 5 ملم، 300 ملم، 500 ملم، 750 ملم و 1،000 ملم من كلوريد الصوديوم الذي يتم إنشاؤه عن طريق خلط العازلة A (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملي PMSF) والعازلة B (1 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم PMSF). ضبط معدل تدفق عند 0.5 مل / دقيقة. جمع الكسر Mgm101 والتحقق من نقاء من البروتين على هلام SDS-PAGE (الشكل 5B).

4. حجم اللوني الاستبعاد

  1. الجمع بين الكسور البروتين من اللوني تبادل الأيونات الموجبة. Dialyze البروتين في المخزن موازنة GF (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 1MM EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 5 مم 2 المركابتويثانول؛ 0.2 ملم PMSF).
  2. تركيز البروتين مع VIVASPIN 15R الترشيح الفائق عمود الدوران للحد من حجم إلى ~ 1 مل من خلال الدوران في 3،000 XG في 4 درجات مئوية.
  3. تحميل Mgm101 سNA معايرة Superose 6 الإعدادية الصف العمود معايرتها مع العازلة اللوني (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي β-المركابتويثانول؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 0.2 ملم PMSF).
  4. بدء الاستبعاد حجم المخزن المؤقت مع اللوني تشغيل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
  5. جمع الكسور لتنقية Mgm101 القمم. تحميل مأخوذة من الكسور على 12٪ SDS-PAGE لفحص الجودة النهائية من البروتين.
  6. تركيز البروتين مع VIVASPIN 6، ثم تجمد بسرعة العينات في N2 السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  7. استخدام Mgm101 العينات في غضون 6-12 شهرا لفحص ssDNA ملزم (الشكل 8) وعن التصور الهيكلي من قبل انتقال الإلكترون المجهري (الشكل 9).

النتائج

Mgm101 هو بروتين إعادة التركيب ذات الصلة Rad52 في الميتوكوندريا. وقد درس على نطاق واسع Rad52 لدورها في إعادة التركيب الحمض النووي (الشكل 1). المؤتلف Mgm101 يمكن أن تعده إجراء ثلاث خطوات (الشكل 2). ومما يسهل ذلك عن طريق استخدام استراتيجية MBP الجغرافية التي تسمح Mgm101...

Discussion

لقد كان التحدي لإنتاج مستقر، وأصلي المؤتلف Mgm101 البروتين من E. القولونية وربما يعود ذلك إلى الذوبان في الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير، وتبين لنا أن الاستراتيجية MBP الانصهار يسمح للبروتين أن أعرب على مستوى عال إلى حد معقول. باستخدام السلبية تلطيخ انتقال المجهر ?...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر يلكنز ستيفان لمساعدة في انتقال المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AG023731.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Expression vector pMAL-c2ENew England Biolabs#N8066S
PreScission ProteaseGE Healthcare Life Sciences#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cellsStrategene#230245
LeupeptinRoche Applied Science#11034626001
PepstatinRoche Applied Science#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Applied Science#10837091001
DNAse ISigma#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Roche Applied Science#11411446001
Amylose resinNew England Biolabs#E8021L
Econo-Column chromatography columnBIO-RAD#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)BIO-RAD#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS15RH02
Superose 6 prep grade columnAmersham Bioscirnces#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS0611

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

76 Mgm101 Rad52 mtDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved