Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

Riepilogo

Il lievito mitocondriale proteina nucleoide, Mgm101, è una proteina di ricombinazione RAD52-tipo che forma grandi anelli oligomeriche. Un protocollo è descritto da preparare Mgm101 solubile ricombinante utilizzando la proteina legante il maltosio (MBP)-tagging strategia accoppiato con scambio cationico e cromatografia ad esclusione dimensionale.

Abstract

Il gene è stato identificato MGM101 20 anni fa per il suo ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale. Studi condotti in diversi gruppi hanno suggerito che la proteina Mgm101 è coinvolta nella riparazione ricombinazione del DNA mitocondriale. Recenti indagini hanno indicato che Mgm101 è legato alla famiglia RAD52-tipo ricombinazione proteica. Queste proteine ​​formano grandi anelli oligomeriche e promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. Tuttavia, la caratterizzazione di Mgm101 è stata ostacolata dalla difficoltà di produrre la proteina ricombinante. Qui, una procedura affidabile per la preparazione di Mgm101 ricombinante è descritto. Il maltosio Binding Protein (MBP)-tag Mgm101 è prima espressa in Escherichia coli. La proteina di fusione è inizialmente purificato mediante cromatografia di affinità amilosio. Dopo essere stato rilasciato da clivaggio proteolitico, Mgm101 è separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Monodisperso Mgm101 è quindi ottenutoper cromatografia ad esclusione dimensionale. Una resa di ~ 0,87 mg di Mgm101 per litro di coltura batterica può essere ottenuta routine. Il Mgm101 ricombinante ha la contaminazione minima di DNA. I campioni preparati sono utilizzati con successo per biochimici, strutturali e singola particella analisi dell'immagine di Mgm101. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di altri grandi oligomeriche proteine ​​che legano il DNA che possono essere mal ripiegate e tossici per le cellule batteriche.

Introduzione

Ricombinazione omologa è importante per la riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) e interstrand legami crociati, e per la ripresa della replicazione del DNA da forche di replicazione crollate ^1. Nel convenzionale ricombinazione omologa, la reazione è catalizzata centrale dalle ricombinasi ATP-dipendenti comprese RecA nei procarioti e Rad51 e Dmc1 negli eucarioti ^1-3. Questi ricombinasi formano filamenti nucleoproteici sul ssDNA, che sono essenziali per l'avvio ricerca di omologia e invasione filone all'interno dei modelli di DNA duplex (Figura 1, pannello di sinistra) ^4-7. Oltre alla schema convenzionale, ricombinazione omologa può avvenire anche in maniera RecA/Rad51-independent (figura 1, pannello di destra). Per esempio, il lievito e RAD52 Rad59 proteine ​​possono catalizzare direttamente la ricottura del complementari ssDNA filamenti che sono esposti per resezione di dsDNA pause. Questo processo di ricombinazione, noto come cantareLe filone ricottura, generalmente non comporta omologa l'abbinamento con i modelli di DNA a doppia elica. Dopo la ricottura, code eterologhe vengono rimossi da esonuleasi e nick sono legatura a ripristinare genoma ^8-10 di continuità. Riparazione da parte del singolo meccanismo di ricottura filo è spesso accompagnata da delezioni di sequenze genomiche tra regioni ripetute direttamente.

RAD52 appartiene ad un gruppo eterogeneo di proteine ​​di ricombinazione che sono diffuse tra i batteriofagi ^11. Queste proteine ​​sono conosciute anche come singolo filamento Proteine ​​ricottura (SSAPs), in base alla loro attività nel promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. I migliori SSAPs batteriofagi sono caratterizzati Redβ e Erf dal batteriofagi λ e P22, rect dal profago RAC e la proteina Sak dal Lactococcal fago ul36. Le SSAPs sono strutturalmente caratterizzate da una tipica piega β-β-β-α, sebbene somiglianza è praticamente undetectgrado nelle loro sequenze primarie. Essi ogni forma di grandi anelli omo-oligomeri di 10-14 volte simmetria in vitro ^12-14. Le implicazioni funzionali di questa caratteristica organizzazione strutturale ordine superiore non è ben compreso.

Siamo interessati a capire il meccanismo di ricombinazione omologa nel genoma mitocondriale. Abbiamo precedentemente identificato il gene MGM101 che è essenziale per il mantenimento del mtDNA in Saccharomyces cerevisiae ^15. MGM101 stato successivamente trovato per essere associato con nucleoidi mitocondriali ed è necessario per la tolleranza del mtDNA ad agenti che danneggiano il DNA ^16. Tuttavia, lo studio di Mgm101 è stata frenata nell'ultimo decennio dalla difficoltà di produrre Mgm101 ricombinante. Abbiamo recentemente riusciti a produrre Mgm101 solubile in grandi quantità da E. coli usando la strategia di MBP-fusion. Questo ci ha permesso di dimostrare che Mgm101 azionisimilitudini biochimiche e strutturali con il RAD52-famiglia di proteine ^​​17,18. In questo rapporto, una procedura di purificazione in tre fasi è descritta, che produce Mgm101for analisi biochimiche e strutturali omogenee (Figura 2).

Protocollo

Precedenti studi hanno dimostrato che i primi amino-terminali 22 residui di Mgm101 sono spaccati dopo l'importazione in mitocondri ^19. Per l'espressione in Escherichia coli, la cornice di lettura aperta MGM101 mancano i primi 22 codoni viene amplificato mediante PCR e collocato a valle della sequenza codificante la proteina MASCHIO legante il maltosio (MBP) in una versione modificata del vettore di espressione pMAL-c2e. Questo genera la fusione MBP-Mgm101 con un linker che contiene un sito di taglio per la proteasi prescissione (Figura 3). Il plasmide viene costruito selezionando E. trasformanti coli senza l'IPTG e selezione blu / bianco Xgal. Il plasmide risultante pMAL-C2E-MGM101 viene poi introdotto nella E. coli ceppo BL21-CodonPlus (DE3)-RIL selezionando ampicillina e colonie resistenti cloramfenicolo.

1. Espressione, induzione, Cell Lysis e DNasi Trattamento io

1. InocUlate trasformanti freschi in 10 ml di terreno LB (1% Bacto triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% di NaCl) addizionato con glucosio (0,2%), ampicillina (100 pg / ml) e cloramfenicolo (50 mg / ml). Incubare a 37 ° CO / N con agitazione a 200 rpm.
2. Inoculare il ml precoltura 10 in 2 litri di terreno LB integrato come sopra. Crescere le cellule a 37 ° C con agitazione fino a OD ₆₀₀ raggiunge 0,5.
3. Indurre l'espressione della proteina di fusione MBP-Mgm101 aggiungendo isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,3 mM. Crescere le cellule in agitazione a 30 ° C per 5 ore.
4. Raccogliere le cellule per centrifugazione utilizzando una Beckman JA-10 rotore (5.500 xg, a 4 ° C, 10 min). Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 30 ml di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 1 mM EDTA, pH 7,4) contenente inibitori delle proteasi (25 pM leupeptina, 1 pM pepstatina A e 1 mM PMSF).
5. Sonicare sospensione cellulare in ghiaccio per 20sec utilizzando un processore ad ultrasuoni (Sistemi di calore; modello W-385) al duty cycle del 50%, lasciare raffreddare in ghiaccio per 30 secondi, e ripetere 2x.
6. Aggiungere 1 ml di DNAse 1 magazzino a 2 mg / ml. Rock il lisato cellulare a 4 ° C per 2 h.
7. Regolare NaCl ad una concentrazione finale di 500 mm.
8. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C per 30 min.

2. Purificazione con amilosio Affinity Chromatography

1. Equilibrare 1,5 ml di resina amilosio (50% slurry) nel tampone di lisi. Aggiungere la resina amilosio equilibrata al lisato cellulare. Agitare delicatamente a 4 ° CO / N.
2. Caricare il mix lisato-resina su una colonna cromatografica Econo-colonna installata in una stanza fredda. Lasciare le proteine ​​non legate al passaggio della colonna per gravità.
3. Lavare la resina con amilosio 300 ml di tampone di lavaggio I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF).
4. Ripetere il lavaggio con 150 ml di tampone di lavaggio II (20 mm tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF).
5. Aggiungere 5 ml di tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF, 10 mM maltosio) alla colonna, incubare a 4 ° C per 10 min, raccogliere l'eluato e ripetere per più volte.
6. Combinare gli eluati, determinare la resa e la purezza di MBP-Mgm101 caricando una aliquota dell'eluato su un gel SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie (Figura 4).

3. Prescissione proteasi Decolleté e cromatografia a scambio cationico

1. Aggiungere 50 unità di prescissione proteasi per l'eluato MBP-Mgm101. Eseguire la scissione a 4 ° CO / N e lasciarlo continuare durante la dialisi contro il tampone di dialisi (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, e 0,2 mM PMSF)
2. Controllare l'efficienza della fenditura su un gel SDS-PAGE (Figura 5A).
3. Caricare il spaccati MBP-Mgm101 da iniettare multiplaioni su una cartuccia Mini Macro-Prep Alta S Bio-Scale collegati ad un sistema biologico FPLC doppio passaggio Bio-Rad.
4. Avviare la cromatografia a scambio cationico mediante l'applicazione di un gradiente passo sale di 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm e 1000 mm di NaCl che viene creato da tampone di miscelazione A (5 mM NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2; 1 mM PMSF) e tampone B (1 M NaCl, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 mM PMSF). Impostare la velocità di flusso a 0,5 ml / min. Raccogliere la frazione Mgm101 e controllare la purezza della proteina su un gel SDS-PAGE (Figura 5B).

4. Size Exclusion Chromatography

1. Unire le frazioni proteiche da cromatografia a scambio cationico. Dializzare la proteina in tampone di equilibrazione GF (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM di 2-mercaptoetanolo, 0,2 mM PMSF).
2. Concentrare la proteina con Vivaspin 15R colonnine ultrafiltrazione a ridurre il volume a ~ 1 ml mediante filatura a 3000 xga 4 ° C.
3. Caricare Mgm101 ona calibrato Superose 6 prep grade colonna equilibrata con il tampone di cromatografia (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF).
4. Avviare la dimensione del buffer con esclusione cromatografia funzionare ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min.
5. Raccogliere le frazioni di purificate Mgm101 picchi. Caricare aliquote delle frazioni su un 12% SDS-PAGE per il controllo della qualità finale della proteina.
6. Concentrato della proteina con Vivaspin 6, poi congelare rapidamente i campioni in N2 liquido e conservare a -80 ° C.
7. Utilizzare i campioni Mgm101 entro 6-12 mesi per i test ssDNA-binding (Figura 8) e per la visualizzazione strutturale di microscopia elettronica a trasmissione (Figura 9).

Risultati

Mgm101 è una proteina di ricombinazione RAD52-correlati nei mitocondri. RAD52 è stato ampiamente studiato per il suo ruolo nella ricombinazione del DNA mitocondriale (Figura 1). Ricombinante Mgm101 può essere preparato da una procedura in tre fasi (Figura 2). Ciò è facilitato dall'utilizzo della strategia MBP-tagging che permette Mgm101 essere espressi in una forma solubile e successivamente rilasciato dal tag da taglio proteolitico (Figura 3).

Discussione

E 'stata una sfida per la produzione di una stalla, nativo Mgm101 proteina ricombinante da E. coli forse a causa della sua insolubilità in cellule batteriche. In questo rapporto, si dimostra che la strategia di MBP-fusione permette la proteina da esprimere ad un livello ragionevolmente elevato. Mediante microscopia elettronica a colorazione negativa e cromatografia ad esclusione dimensionale, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina di fusione MBP-forma oligomeri uniformi in vitro ^1...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611