Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

Resumen

La proteína nucleoide mitocondrial de levadura, Mgm101, es una proteína de recombinación de tipo Rad52 que forma grandes anillos de oligómeros. Un protocolo se describe la preparación Mgm101 recombinante soluble usando la proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetado estrategia junto con intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño.

Resumen

El gen MGM101 se identificó hace 20 años por su papel en el mantenimiento de ADN mitocondrial. Los estudios de varios grupos han sugerido que la proteína Mgm101 está implicado en la reparación de recombinación de ADN mitocondrial. Recientes investigaciones han indicado que Mgm101 se relaciona con la familia de proteínas de recombinación de tipo Rad52. Estas proteínas forman grandes anillos de oligómeros y promueven la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Sin embargo, la caracterización de Mgm101 se ha visto obstaculizada por la dificultad en la producción de la proteína recombinante. Aquí, se describe un procedimiento fiable para la preparación de Mgm101 recombinante. Proteína de unión a maltosa (MBP)-etiquetados Mgm101 se expresa primero en Escherichia coli. La proteína de fusión se purificó inicialmente por cromatografía de afinidad de amilosa. Después de ser liberado por escisión proteolítica, Mgm101 se separa de MBP por cromatografía de intercambio catiónico. Monodispersada Mgm101 se obtiene despuéspor cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtiene un rendimiento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultivo bacteriano puede ser obtenido de forma rutinaria. El Mgm101 recombinante tiene un mínimo de contaminación de ADN. Las muestras preparadas se utilizan con éxito para el análisis de imágenes de partículas bioquímicas, estructurales e individuales de Mgm101. Este protocolo también se puede usar para la preparación de otras proteínas de unión al ADN oligoméricas grandes que pueden ser mal plegadas y tóxico para las células bacterianas.

Introducción

La recombinación homóloga es importante para la reparación de doble filamento se rompe (DSBs) y enlaces cruzados, y para la reiniciación de la replicación del ADN a partir de horquillas de replicación se derrumbó ^1. En la recombinación homóloga convencional, el centro de reacción es catalizada por las recombinasas dependientes de ATP incluyendo RecA en procariotas, y Rad51 y Dmc1 en eucariotas ^1-3. Estas recombinaciones forman nucleoprotein filamentos en ssDNA, que son esenciales para iniciar la búsqueda de homología y el capítulo invasión dentro de moldes de ADN dúplex (Figura 1, panel izquierdo) ^4-7. Además del esquema convencional, la recombinación homóloga también puede tener lugar de una manera RecA/Rad51-independent (Figura 1, panel derecho). Por ejemplo, las proteínas de levadura Rad52 y Rad59 pueden catalizar directamente la hibridación de cadenas de ADNmc complementarias que están expuestos por resección de roturas de ADN de doble cadena. Este proceso de recombinación, conocido como cantarle línea de recocido, por lo general no implica homóloga de emparejamiento con las plantillas de ADN de doble cadena. Después del recocido, colas heterólogas se eliminan por exonucleasas y mellas se ligan para restaurar la continuidad del genoma ^8-10. Reparación por el mismo mecanismo de recocido capítulo suele ir acompañada de las supresiones de secuencias genómicas entre las regiones directamente repetidas.

Rad52 pertenece a un grupo diverso de proteínas de recombinación que son muy extendida entre bacteriófagos ^11. Estas proteínas también se conocen como proteínas individuales de recocido Strand (SSAP), sobre la base de su actividad en la promoción de la hibridación de moléculas de ADN homólogas de cadena sencilla. Los mejores SSAP bacteriófagos son caracterizados Redβ y Erf del bacteriófagos λ y P22, RecT del profago rac y la proteína Sak del fago lactococcal UL36. Los SSAP se caracterizan estructuralmente por un típico pliegue β-β-β-α, aunque similitud es prácticamente indetectablepoder en sus secuencias primarias. Todos ellos forman grandes anillos homo-oligómeros de 10-14 simetría veces in vitro ^12-14. Las consecuencias funcionales de la organización estructural de orden superior característica no se entiende bien.

Estamos interesados ​​en la comprensión del mecanismo de la recombinación homóloga en el genoma mitocondrial. Anteriormente hemos identificado el gen MGM101 que es esencial para el mantenimiento de ADNmt en Saccharomyces cerevisiae ^15. MGM101 posteriormente se encontró que se asocia con nucleoides mitocondriales y es necesario para la tolerancia de ADNmt a los agentes que dañan el ADN ^16. Sin embargo, el estudio de Mgm101 ha sido muy limitado en la última década por la dificultad para producir Mgm101 recombinante. Hemos tenido éxito recientemente en la producción de Mgm101 soluble en grandes cantidades a partir de E. coli mediante la estrategia de fusión MBP. Esto nos ha permitido demostrar que Mgm101 accionessimilitudes bioquímicas y estructurales con la Rad52-familia de proteínas ^17,18. En este informe, se describe un procedimiento de purificación de tres etapas, que produce los análisis bioquímicos y estructurales Mgm101for homogéneos (Figura 2).

Protocolo

Estudios previos han demostrado que los primeros amino-terminal de 22 residuos de Mgm101 se escinden después de la importación en mitocondrias ^19. Para la expresión en Escherichia coli, el marco de lectura abierto MGM101 carece de los primeros 22 codones se amplifica por PCR y se coloca aguas abajo de la secuencia de malE que codifica la proteína de unión a maltosa (MBP) en una versión modificada del vector de expresión pMAL-c2E. Esto genera la fusión MBP-Mgm101 con un enlazador que contiene un sitio de escisión para la proteasa PreScission (Figura 3). El plásmido se construyó por primera vez por la selección de E. transformantes de E. coli sin IPTG y selección azul / blanco Xgal. El plásmido pMAL-c2E-MGM101 resultante se introduce luego en la E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RIL mediante la selección de colonias resistentes a la ampicilina y cloranfenicol.

1. Expresión, Inducción, lisis celular y DNasa I tratamiento

1. INOCular transformantes frescos en 10 ml de medio LB (1% de Bacto triptona, extracto de levadura al 0,5%, 1% de NaCl) suplementado con glucosa (0,2%), ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (50 mg / ml). Incubar a 37 ° CO / N con agitación a 200 rpm.
2. Inocular el precultivo 10 ml en 2 litros del medio LB suplementado como anteriormente. Cultivar las células a 37 ° C con agitación hasta una _DO600 alcanza 0,5.
3. Inducir la expresión de la proteína de fusión MBP-Mgm101 mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,3 mM. Cultivar las células con agitación a 30 ° C durante 5 h.
4. Recoger las células por centrifugación usando un JA-10 rotor Beckman (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Después de desechar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 30 ml de tampón de lisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM, pH 7,4) que contiene inhibidores de la proteasa (leupeptina 25 mM, pepstatina A 1 mM y PMSF 1 mM).
5. Someter a ultrasonidos suspensión de células en hielo durante 20seg usando un procesador ultrasónico (Heat Systems, Modelo W-385) en el ciclo de trabajo del 50%, se deja enfriar en hielo durante 30 seg, y repetir 2x.
6. Añadir 1 ml de DNAsa 1 stock a 2 mg / ml. Oscilar el lisado de células a 4 ° C durante 2 horas.
7. Ajuste de NaCl a una concentración final de 500 mM.
8. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C durante 30 min.

2. La purificación con cromatografía de afinidad de amilosa

1. Equilibrar 1,5 ml de resina de amilosa (50% suspensión) en el tampón de lisis. Añadir la resina de amilosa equilibrada para el lisado de células. Agite suavemente a 4 º CO / N.
2. Cargar la mezcla de lisado-resina en una columna de cromatografía de columna Econo-instalado en una habitación fría. Permita que las proteínas no unidas a pasar la columna por gravedad.
3. Lavar la resina de amilosa con 300 ml del tampón de lavado I (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 400 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF).
4. Repetir el lavado con 150 ml de tampón de lavado II (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF).
5. Añadir 5 ml de tampón de elución (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4, y 0,2 mM de PMSF, 10 mM de maltosa) a la columna, incubar a 4 ° C durante 10 min, recoger el efluente y repita para más veces.
6. Combinar los eluatos, determinar el rendimiento y la pureza de MBP-Mgm101 mediante la carga de una parte alícuota del eluido en un gel de SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie (Figura 4).

3. PreScission escisión de la proteasa y Cromatografía de intercambio catiónico

1. Añadir 50 unidades de proteasa PreScission al eluato MBP-Mgm101. Realizar la escisión en 4 ° CO / N y permitir que continúe durante la diálisis contra el tampón de diálisis (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM de NaCl; DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, y 0,2 mM PMSF)
2. Controlar la eficacia de la escisión en un gel de SDS-PAGE (Figura 5A).
3. Cargue el troceados MBP-Mgm101 por múltiples inyectariones en un cartucho Mini Macro-Prep High S Bio-Escala conectados a un sistema de FPLC de doble paso biológica Bio-Rad.
4. Iniciar la cromatografía de intercambio catiónico mediante la aplicación de un gradiente de paso de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM y 1,000 mM de NaCl que se crea mediante la mezcla de tampón A (5 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM PMSF) y Tampón B (NaCl 1 M, 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2; 1 mM de PMSF). Establecer la velocidad de flujo a 0,5 ml / min. Recoger la fracción Mgm101 y comprobar la pureza de la proteína en un gel de SDS-PAGE (Figura 5B).

4. Cromatografía de Exclusión de Tamaño

1. Combinar las fracciones de proteínas de cromatografía de intercambio catiónico. Dializar la proteína en el tampón de equilibrado GF (MOPS 20 mM, pH 7,0; NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4; 5 mM 2-mercaptoetanol 0,2 mM PMSF).
2. Se concentra la proteína con columna de centrifugación de ultrafiltración Vivaspin 15R para reducir el volumen a ~ 1 ml por centrifugación a 3000 xg a 4 ° C.
3. Cargar Mgm101 ona calibrado Superose 6 prep columna grado equilibrada con el tampón de cromatografía (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7,4; 0,2 mM PMSF).
4. Iniciar la exclusión por tamaño con el tampón de cromatografía se ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min.
5. Reunir las fracciones de los purificados Mgm101 picos. Cargar alícuotas de las fracciones en un 12% SDS-PAGE para comprobar la calidad final de la proteína.
6. Concentrado de la proteína con Vivaspin 6, a continuación, congelar rápidamente las muestras en N2 líquido y se almacena a -80 ° C.
7. Usa los Mgm101 muestras dentro de 6-12 meses para el ensayo de unión al ADNmc (Figura 8) y para la visualización estructural por microscopía electrónica de transmisión (Figura 9).

Resultados

Mgm101 es una proteína Rad52 recombinación relacionada en la mitocondria. Rad52 ha sido ampliamente estudiado por su papel en la recombinación del ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante se puede preparar mediante un procedimiento de tres pasos (Figura 2). Esto se ve facilitado por el uso de la estrategia de MBP-etiquetado que permite Mgm101 a ser expresado en una forma soluble y posteriormente liberado de la etiqueta mediante escisión proteolítica (Figura 3).

Discusión

Ha sido un reto para producir una proteína estable, nativo recombinante Mgm101 de E. coli posiblemente debido a su insolubilidad en células bacterianas. En este informe, muestran que la estrategia de fusión MBP permite que la proteína que se expresa en un nivel razonablemente alto. Mediante el uso de tinción negativa microscopía electrónica de transmisión y cromatografía de exclusión por tamaño, hemos demostrado previamente que la proteína de fusión MBP forma oligómeros uniformes in vitro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611