MBP基于标记策略的Mgm101重组蛋白的制备

摘要

酵母线粒体类核蛋白质，Mgm101，是一种重组蛋白RAD52型，形成大低聚环。甲协议的描述以制备可溶性的重组Mgm101使用麦芽糖结合蛋白（MBP）标记加上阳离子交换和尺寸排阻色谱法策略。

摘要

20年前被确定MGM101基因维护线粒体DNA中的作用。从几组研究表明，的Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复。最近的调查表明，Mgm101 RAD52型重组蛋白家族有关。这些蛋白质形成大的低聚环促进退火同源单链DNA分子。然而，表征阻碍了Mgm101的生产重组蛋白的难度。在这里，用于制备重组Mgm101的一个可靠的程序进行说明。麦芽糖结合蛋白（MBP）标签Mgm101的首先在大肠杆菌中表达。最初是由直链淀粉的亲和层析柱纯化的融合蛋白。在被释放后通过蛋白水解裂解，Mgm101从MBP分离，通过阳离子交换色谱法。然后单分散Mgm101是获得通过尺寸排阻色谱法。可以定期获得的产量为〜0.87毫克每升细菌培养Mgm101。该的重组Mgm101有DNA污染最小。对样品成功地用于生化，结构和单粒子图像分析Mgm101。此步骤也可用于制备其它大的低聚物的DNA结合蛋白，可能会被错误折叠的和细菌细胞毒性的。

引言

同源重组是非常重要的双链断裂的修复（DNA双链断裂）和链间交联，并从倒塌的复制叉¹重新开始DNA复制。在常规的同源重组，中央的反应由ATP-依赖的重组酶RecA蛋白在原核细胞中，在真核生物中^1-3的Rad51和Dmc1。这些重组酶形成核蛋白丝的单链DNA，这是必不可少的双链DNA模板（ 图1，左侧面板^）4-7内发起同源搜索和钢绞线入侵。除了 ​​常规的计划，同源重组也可以采取地方在RecA/Rad51-independent的方式（ 图1，右图）。例如，酵母的保守和Rad59蛋白质可以直接催化切除双链DNA断裂露出的互补单链DNA链退火。这个重组过程中，被称为唱乐链退火，一般不涉及同源配对的双链DNA模板。退火后，除去核酸外切酶的异源尾巴刻痕结扎以恢复基因组连续性^8-10。常伴有直接重复区域之间的基因组序列缺失修复由单链退火机制。

RAD52属于普遍噬菌体¹¹的重组蛋白质，是一个多元化的群体。这些蛋白质也被称为单链退火蛋白（会计实务准则），根据他们的活动在促进同源的单链DNA分子退火。最好噬菌体会计实务准则Redβ的的ERF从噬菌体λ噬菌体rac和葡激酶蛋白从噬菌体lactococcal UL36和P22，RECT。的会计准则结构其特征在于由一个典型的β-β-β-α倍，虽然相似，几乎检测不到能够在他们的主要序列。他们都形成大的同源寡聚体环10 - 14倍的对称性在体外 ^12-14。这一特点高阶的组织结构功能的影响还不是很清楚。

我们有兴趣了解线粒体基因组同源重组的机制。我们先前已经确定MGM101是必不可少的维护在酿酒酵母 ¹⁵线粒体DNA的基因。MGM101后来发现线粒体拟核相关需要的耐受性线粒体DNA损伤剂^16。然而，这项研究已Mgm101忍住在过去十年中的难度生产重组Mgm101。最近，我们已经成功地大量生产可溶性Mgm101在从E大肠杆菌使用的MBP融合策略。这使我们能够证明Mgm101股生化和结构的相似性与RAD52家族蛋白^17,18。在这份报告中，三个步骤的纯化过程进行了描述，产生均匀Mgm101for的生化和结构分析（ 图2）。

研究方案

以前的研究已经表明，第一个氨基末端的22个氨基酸残基的Mgm101裂解后，导入到线粒体^19。对于在大肠杆菌中的表达，通过PCR扩增MGM101缺乏的前22个密码子的开放读码框放在男性的编码序列的表达载体pMAL-C2E的修改版本，麦芽糖结合蛋白（MBP）的下游。这会产生的MBP-Mgm101的的断前蛋白酶（ 图3）与一个连接器包含一个切割位点的融合。首次构建质粒选择E。大肠杆菌转化，而 ​​不IPTG和的Xgal蓝色/白选择。将得到的质粒pMAL-C2E MGM101然后导入大肠杆菌大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，选择氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落。

1。表达，诱导，细胞裂解和DNase I处理

1. 伊诺克ulate新鲜的转化体在10ml补充有葡萄糖（0.2％），氨苄青霉素（100微克/毫升）和氯霉素（50微克/毫升）的LB培养基（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠）。在200转摇孵育在37°CO / N。
2. 为2升与上述补充的LB培养基中，接种10毫升的预培养物。成长的细胞在37℃振荡，直到OD ₆₀₀达到0.5。
3. 通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），使最终浓度为0.3 mM，的MBP-Mgm101的融合蛋白的诱导表达。 5小时，在30℃振荡，细胞生长。
4. 收集细胞，通过离心分离，用Beckman JA-10转子（5500×g离心，4℃下，10分钟）。后弃去上清，重悬细胞沉淀在30ml含有蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽（25μM，1μM的胃酶抑素A和1mM的PMSF）的裂解缓冲液（的的20mM Tris-HCl，pH值7.4和1mM EDTA，pH值7.4）。
5. 超声细胞悬浮液，冰浴20秒使用超声波处理器（热系统，型号W-385），在占空比为50％时，允许在冰上冷却30秒，然后重复2倍。
6. 添加1毫升DNA酶1股票在2毫克/毫升。细胞裂解液在4℃下摇动2小时。
7. 调整的NaCl至终浓度为500 mM。
8. 中取出的细胞碎片。在4℃下以10,000 xg离心30分钟。

2。与直链淀粉亲和层析纯化

1. 平衡1.5毫升的裂解缓冲液中的直链淀粉树脂（50％浆液）。平衡直链淀粉树脂加入细胞裂解物。轻轻摇动4°CO / N
2. 加载到Econo柱层析柱安装在冷室中的溶胞产物 - 树脂混合物。允许未结合的蛋白质，通过重力柱。
3. 洗净，用300毫升的洗涤缓冲液I（的20mM Tris-盐酸，pH值7.4，400 mM氯化钠，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF）的直链淀粉树脂。
4. 重复洗涤用150ml洗涤缓冲液II（20 mm T型的上升HCl，pH值7.4，200 mM氯化钠，1mM的EDTA，pH为7.4，为0.2mM PMSF）。
5. 加入5毫升的洗脱缓冲液（的20mM的Tris-HCl，pH值7.4，200 mM氯化钠，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF，10mM的麦芽糖）柱中，温育在4℃下进行10分钟，收集洗脱液重复多次。
6. 合并洗脱液，确定通过加载后，以考马斯亮蓝染色（ 图4）上的SDS-PAGE凝胶的洗脱液的等分试样MBP-Mgm101的产率和纯度。

3。断前蛋白酶裂解和阳离子交换层析

1. 添加50单位PreScission蛋白酶到的MBP-Mgm101洗脱液。在4℃下进行裂解位的CO / N，并允许它继续透析过程中对透析缓冲液（的的20mM Tris-HCl，pH值7.4，100 mM氯化钠，2mM的DTT，1mM EDTA的溶液，pH值7.4和0.2mM的PMSF）
2. SDS-PAGE凝胶上（ 图5A），检查裂解的效率。
3. 由多个注入负荷切割MBP Mgm101离子在生物秤迷你宏观准备高S墨盒连接到Bio-Rad公司生物DuoFlow FPLC系统。
4. 开始的阳离子交换色谱法，申请的步骤盐梯度为5mM，300mM的，500毫米，750毫米和1,000 mM NaCl的混合缓冲液A（5 mM氯化钠所建立的;​​的10mM磷酸钠，pH为7.2; mM的PMSF）和缓冲液B（1M NaCl的10mM的磷酸钠，pH为7.2，1mM的PMSF）。设置在0.5毫升/分钟的流速。收集Mgm101馏分和检查产品的纯度的蛋白在SDS-PAGE凝胶（ 图5B）。

4。尺寸排阻色谱法

1. 结合从阳离子交换色谱的蛋白质部分。透析GF平衡缓冲液中的蛋白质（的20mM MOPS，pH为7.0，150 mM氯化钠，1mM的EDTA，pH值7.4，5mM的2 - 巯基乙醇，0.2mM的PMSF）。
2. VIVASPIN 15R超滤离心柱浓缩蛋白，以3000×g在4℃下通过纺丝，以减低音量〜1毫升
3. 装载Mgm101Ø呐校准SUPEROSE 6制备级柱层析缓冲液平衡过的20mM MOPS，pH为7.0，150 mM氯化钠，5mM的β-巯基乙醇，1mM EDTA的溶液，pH值7.4，0.2mM的PMSF。
4. 尺寸排阻色谱运行缓冲液，流速为0.5ml /分钟。
5. 收集的零碎，纯化Mgm101峰。负载的等分试样的级分在12％的SDS-PAGE检查蛋白质的最终质量。
6. 与VIVASPIN 6浓缩蛋白，然后迅速冻结样品在液氮中并储存在-80℃下
7. 中使用Mgm101样品在6-12个月内单链DNA结合测定（ 图8），并用透射电子显微镜（ 图9）的结构的可视化。

结果

Mgm101是一个RAD52在线粒体相关的重组蛋白。 RAD52已被广泛研究，它的作用在线粒体DNA重组（ 图1）。重组Mgm101可以准备通过三个步骤（ 图2）。这是促进所使用的MBP的标记策略，允许以可溶形式表达在Mgm101从标签的蛋白水解裂解，随后被释放（ 图3）。

在一个典型的制备方法中，约2-3毫克，MBP-Mgm101融合可以被回收后，直链淀粉的亲和层析?...

讨论

它一直是一个挑战，产生一个稳定的，原生的重组Mgm101蛋白E.大肠杆菌可能是由于其在细菌细胞中的不溶性。在这份报告中，我们表明，MBP融合战略使蛋白质表示在相当高的水平。通过负染色透射电子显微镜和尺寸排阻色谱法，我们以前曾表明，MBP的融合蛋白在体外 ¹⁸形成均匀的低聚物。这是可能的折叠和低聚Mgm101的，可能比较慢线粒体基质相比，细菌细胞中。 unoligomerized Mg...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611