تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Summary

نحن هنا تصف طريقة عامة لفحص عشوائي microseed المصفوفة. ويظهر هذا الأسلوب إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح بلورة البروتين التجارب الفرز، وتقلل من الحاجة إلى التحسين، وتوفير إمدادات موثوقة من بلورات لجمع البيانات والتجارب يجند تمرغ.

Abstract

فحص عشوائي microseed مصفوفة (rMMS) هو أسلوب بلورة البروتين في البلورات التي تضاف إلى البذور شاشات عشوائي. عن طريق زيادة احتمال أن بلورات سوف تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من مرحلة رسم تخطيطي بروتين، وغالبا ما يتم الحصول عليها يؤدي تبلور اضافية، ويمكن زيادة جودة البلورات المنتجة، ويتم توفير امدادات جيدة من بلورات لتجارب جمع البيانات وتمرغ. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS التي يمكن تطبيقها إما الجلوس أو قطرة قطرة شنقا التجارب نشر بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 96 جيدا أو شكل علبة 24 أيضا.

Introduction

من التطبيق الأولي من خلال Perutz، Kendrew وزملاء العمل في تحديد هياكل الهيموجلوبين والميوجلوبين، إلى إنتاجية عالية خطوط الأنابيب الحديثة الآلي للاتحادات الجينوميات الهيكلي، والجزيئات البلورات بالأشعة السينية قد أتاحت لنا لمحة هيكلية غير مسبوقة في عالم البروتين . لا تزال هذه التقنية المنهج التجريبي الأكثر انطباقا على نطاق واسع أن يسمح للرؤية مباشرة من بنية البروتين في الذرية، أو بالقرب القرار الذري (أي في حدود 1-3). ومن الشروط الأساسية لحيود الأشعة السينية ليتم تطبيقها على البروتين هو أنه يجب أولا أن تبلور، وهذا هو مرحلة من مراحل العملية التي لا تزال أعظم خطوة الحد من معدل واحد في تحديد هيكل بالطرق الحيود ^{1 و 2.} على الرغم من التقدم الكبير في فهمنا لعملية بلورة البروتين، وتحسينات كبيرة في نوعية وتوافر شاشات التبلور،الصواني، والتكنولوجيات ذات الصلة، فإنه لا يزال من المستحيل التنبؤ بشكل موثوق من احتمال نجاح تبلور ^3. ويمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية لتقييم ما إذا كان البروتين من الفائدة يعرض خصائص مواتية لالتنوي الكريستال والنمو، أي هو مطوية جيدا، متجانسة، monodisperse، وما إلى ذلك، ولكن هذه الأفكار في أي وسيلة توفر مؤشرا نهائيا التبلور الميل.

منذ فترة طويلة البذر يزعم أن يكون وسيلة ناجعة لتحسين عدد وحجم ونوعية بلورات القائمة أو المواد البلورية ^4-7. ويستند هذا النهج على أساس أن شرط أن يدعم الكريستال التنوي قد لا تكون الأمثل لنمو البلورات اللاحقة والعكس بالعكس. عن طريق نقل المواد الأنوية من حالة إلى أخرى، يمكن للمرء أن محاولة فصل هذه العمليات بشكل فعال، وبالتالي إعطاء الوصول إلى الجديد، كما تبلور الفضاء غير مستكشفة بعد،ونتيجة لزيادة معدل النجاح العام من تجربة الفرز. وقد تم توثيق طرق أنشئت ل(ط) macroseeding، ونقل من بلورة واحدة في مجملها من شرط واحد إلى ⁸ آخر، (ب) بذر متتالية، ونقل المواد الأنوية، التي تم الحصول عليها بشكل عام من تطبيق الضغط باستخدام الاتجاه على سبيل المثال الخط الطولي القط على سطح بلورة القائمة، تليها مرور لاحقة من الخط الطولي من خلال انخفاض تبلور الجديدة ^9، و (ج) "الكلاسيكية" microseeding، ونقل الكريستال "بذور"، التي تم إنشاؤها بواسطة الحصاد سحق بلورات (أو البلورية المواد)، في ظروف مماثلة لتلك التي أسفرت عن بذور ^10. وخاصة كل ثلاثة من هذه الأساليب هي مضيعة للوقت وسوء تحجيم، وبالتأكيد بالمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع الحديث مناولة السائل الروبوتات التبلور. وقد ساهمت هذه العوامل، على مستوى بعض على الأقل، إلى الاعتقاد بأن البذورجي هو طريقة في أن يزوره فقط عندما فشلت المقاربات الأخرى لتؤتي ثمارها.

مصفوفة عشوائية microseeding (rMMS) هو الابتكار المنهجي الأخيرة الذي يجمع بين فوائد microseeding التقليدية مع تلك الفحص إنتاجية عالية وقابلية ^11-13. يعتمد هذا النهج على توليد مخزون البذور، والمنتجة من المواد البلورية الأنوية، والتي يمكن aliquoted في / على كل sub-well/coverslip ضمن معيار 96-screen حالة التبلور. هذا الأسلوب ينطبق على كل من يجلس أو شنقا التجارب نشر انخفاض بخار، التي أنشئت إما باليد أو باستخدام الروبوتات مناولة السائل، في 24 جيدا أو شكل علبة 96 جيدا. وقد ثبت بالتجربة rMMS إلى زيادة كبيرة في معدل نجاح التبلور، وإنتاج بلورات من قدر أكبر من الجودة والكمية حيود ^{11، 13، 14،} ويمثل أداة مبتكرة في ترسانة البلورات 'النهج في سngoing الجهد نحو النجاح التبلور. نحن هنا تصف طريقة عامة لrMMS وتوفير بيانات عينة توضح فعالية هذه التقنية.

Protocol

1. الاعتبارات الاستراتيجية

1. واختيار بلورات البذور المستخدمة في التجارب microseeding تختلف اعتمادا على الهدف من التجربة. في بداية المشروع فإنه من المفيد أن تجد العديد من الفعالية تبلور التي يمكن أن توفر نقطة انطلاق بديلة لالكريستال الأمثل. rMMS يقلل كثيرا من الحاجة إلى وضوح الشمس الأمثل لبلورات ذات نوعية جيدة من المرجح أن تنمو في المنطقة متبدل الاستقرار من المخطط المرحلة، أي في المنطقة حيث التالية اضطراب أو التنوي يعود النظام إلى التوازن. لذا نقترح استخدام rMMS بشكل روتيني في أقرب وقت يتم الحصول على بلورات الأولى (أو، بدقة أكبر، في أقرب وقت البلورات الأولى تتوقف عن النمو).
2. للجولة الأولي من rMMS، ينبغي بذل مخزون البذور مع قدر المواد البلورية ممكن. إذا بئر واحدة فقط هي المتاحة التي تحتوي على بلورات، أو إذا كانت بلورات صغيرة، قد يكون من المفيد لاقامة التكرار متعددة منضرب الأصلي (بدون بذر) لزيادة المعروض من بلورات. إذا، ومع ذلك، يتم الحصول على العديد من مشاهدات مختلفة، بلورات البذور يمكن أن تحصد من عدة شروط ومختلطة معا.
3. لتجنب مرحلة الانفصال، بلورات نمت في ظروف عالية من الملح وينبغي أن تحصد بشكل منفصل من بلورات نمت في ظروف عالية PEG. إذا يتم خلط بلورات من عدة آبار، وينبغي اختيار الحل الخزان الذي هو أقل احتمالا لإعطاء بلورات الملح للتعليق البذور. على سبيل المثال، ينبغي تجنب التركيزات العالية من الفوسفات والكبريتات والكالسيوم والمغنيسيوم.
4. في وقت لاحق في مشروع قد يكون من المهم أن نبحث عن بلورات مع الخلايا وحدة مختلفة من أجل تحسين الحيود، وتجنب بلورات توأمة، والحصول على البلورات التي هي مناسبة للبروابط ملزمة. في هذه المرحلة فقط بلورات أكثر ملائمة (مثل تلك التي حيد الضوء أفضل) ينبغي أن تستخدم لجعل مخزون البذور. ويلزم الجولات المتكررة في بعض الأحيان من microseeding، حيث لا يوجد سوى "أفضل"وتستخدم بلورات لجعل مخزون البذور لجولة لاحقة. إذا كان ذلك ممكنا، و" "مرسب محايدة مثل PEG 3000 ينبغي أن تستخدم لتعليق بلورات البذور في تشجيع الاتصالات الكريستال الرواية وبلورة المجمعات التي قد تكون غير مستقرة في ارتفاع الملح حلول ^12.
5. تجارب microseeding الكلاسيكية، حيث يتم استخدام حالة تبلور واحد، وغالبا ما تكون مفيدة عقب تحديد حالة واعدة وخلال التحسين اللاحقة. فمن الضروري في كثير من الأحيان لتخفيف مخزون البذور من أجل الحصول على العدد المطلوب من بلورات من كل قطرة ماء. A "اندماجي" التجربة microseeding (حيث يتم إضافة سلسلة من مخزونات البذور لزيادة التخفيف إلى حالة تبلور) هو وسيلة سريعة للعثور على التخفيف الأمثل للمخزون البذور. يوصف هذا النهج أدناه.

2. إعداد مخزون البذور

1. جعل التحقيق الزجاج مقربة من ماصة باستير الزجاج باستخدام لهب بنسن.
   1. تسخين ماصة بالقرب من منتصف حتى تصبح لينة، ثم إزالته بسرعة من اللهب واستدراجه للخروج عن طريق سحب وبصرف النظر عن الغايات. تهدف إلى سحب الزجاج لتصل إلى 0.25 ملم قطر أدناه.
   2. كسر الزجاج عند نقطة حيث حوالي 0.25 ملم لفترة وجيزة يغرق نهاية اقتحام اللهب. كرر هذا حتى نصف الكرة من الزجاج يبلغ قطرها ~ 0.75 مم يتكون في النهاية. هذا التحقيق هو مفيد لسحق المواد البلورية كما هو بحجم مناسب لضرب الأجسام الصلبة على نطاق و،01-1،0 مم وأنها لا تضر سطح البلاستيك من بلورة علبة الفرعية جيدا أو ساترة. تحقيقات الأكبر (~ 1.0 ملم) قد سحق بلورات صغيرة أكثر فعالية لأن محاصرون بلورات بين الزجاج والبلاستيك.
2. وضع 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة على الجليد.
3. فحص علبة بلورة مقررة سلفا باستخدام مجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال وتحديد أب واحد أو أكثرتكبده الآبار من علبة من خلالها حصاد المواد البلورية لتوليد مخزون البذور. أي مواد يمكن استخدامها بما في ذلك إبر رفيعة، spherulites، microcrystals وغير النظامية، وبلورات سيئة. ينبغي بذل مخزون البذور في أقرب وقت ممكن بعد وقف البلورات المتنامية، كما من المرجح أن تكون مرتبطة جزئيا عبر المواد القديمة، وبالتالي تقليل مدى ملاءمتها للاستخدام في التجارب البذر. إذا أي شك موجود حول ما إذا كانت المواد البلورية إلى أن تحصد هو الملح أو البروتين البئر يمكن تصور باستخدام المجهر مضان الأشعة فوق البنفسجية أو نظام التصوير قبل الافتتاح، أو ما قد يتعرضون للمواد البلورية لفي الموقع تحليل حيود الأشعة السينية في الدرج. عند استخدام بلورات السابق البروتين النهج سوف يتألق تحت أشعة فوق البنفسجية، وسوف تظهر بلورات الملح عديم اللون.
4. فتح علبة بلورة اختيارها بشكل جيد. لمدة 96 جيدا يجلس الصواني انخفاض قطع طريق ورقة ختم البلاستيك العلوي حول اختيارها بشكل جيد باليودنانوغرام شفرة المشرط. لمدة 24 جيدا صواني معلقة قطرة إزالة ساترة باستخدام زوج من ملاقط. عكس ساترة ووضعه على سطح نظيف مستقرة. إزالة 50 ميكرولتر من الحل الخزان ونقل هذا السائل إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على بذور حبة ضمان أن يبقى أنبوب على الجليد طوال الوقت.
5. بدقة سحق البلورات في subwell (96 علبة جيدا) أو ساترة (24 علبة جيدا) يسقط، وذلك باستخدام مسبار الزجاج أعدت في القسم 2.1، وعرض النتائج تحت المجهر. بلورات صغيرة قد يستغرق عدة دقائق لسحق تماما. هذه الخطوة يسمح للمجرب للتأكد من أن البلورات هي سهلة لسحق وبالتالي فهي ليست مرتبطة عبر، وأيضا أنها ليست بلورات الملح. بلورات الملح إنتاج بنقرة والمميزة التي يمكن يسمع ويرى عندما يتم سحقها. إذا كانت البلورات هي صعبة وصعبة لسحق محاولة للحصول على مواد أعذب واستخدامها.
6. إزالة 5 ميكرولتر من الحل الخزان من بذور حبة أنبوب وراملحول ليعادل البئر الفرعية (يجلس التجربة قطرة)، أو ساترة (معلقة تجربة قطرة) التي تحتوي على المواد البلورية للحصاد. ماصة هذا الأمر السائل وهبوطا 5-6 مرات ل resuspend أكبر قدر من البئر الفرعية أو ساترة محتويات ممكن. العودة للتعليق على البذور أنبوب حبة وكرر هذه الخطوة مرتين أكثر من ذلك، ضمان قدر المواد البلورية يتم حصاد وقت ممكن.
7. دوامة حبة البذور لمدة دقيقتين، ووقف كل 30 ثانية لتبريد أنبوب على الجليد.
8. جعل سلسلة التخفيف، وتمييع مخزون البذور في محلول الخزان من قبل عامل من 4-10 في كل مرحلة. عادة، وسيتم الحصول على عدد كبير جدا من بلورات عند استخدام مخزون البذور غير مخفف، وذلك باستخدام مخزونات البذور مخففة للسيطرة على عدد من بلورات لكل بئر. في الجولة الأولى من rMMS، فمن المهم عدم تمييع الحل مخزون البذور، لأن كلما زاد تركيز البذور سيتم الحصول على المزيد من الزيارات التبلور.
9. إذا لم يكن ليتم استخدامها immediately، ونقل البذور التعليق الأسهم والأوراق المالية البذور المخفف إلى -20 ° C، أو الفريزر -80 درجة مئوية للتخزين. لمنع تكرار تجميد أذاب دورات، والذي قد يقلل من فعالية مخزون البذور، وتخزين هذه المواد في مأخوذة الحجم الصغير، أي 10-20 ميكرولتر. مرة واحدة المجمدة، ويجوز إبقاء مخزون البذور إلى أجل غير مسمى لحين الحاجة إليها.

3. إنشاء البلورة الصواني

1. اعتمادا على مدى توافر المرافق وتبلور أفضليات المجرب، rMMS بلورة الفرز يمكن القيام بها باستخدام إما الصواني 24 أيضا توظيف شنقا طريقة الانتشار قطرة بخار، أو الصواني 96 جيدا باستخدام طريقة الجلوس قطرة بخار نشرها. يمكن تأسيس الصواني تبلور لrMMS إما باليد، وذلك باستخدام التعامل مع موزع الروبوتية السائل، أو مزيج من الاثنين.
2. وهناك تجربة نموذجية rMMS إعداد باليد تشمل، 1.0 ميكرولتر حل البروتين، 1.0 ميكرولتر حالة التبلور، و0.5 ميكرولتر مخزون البذور. وهناك تجربة نموذجية إعداد باستخدام الروبوت التبلور تشمل حل البروتين 0.3 ميكرولتر و 0.2 ميكرولتر حالة التبلور، و 0.1 ميكرولتر مخزون البذور.
3. لإجراء الفحص في 24 rMMS جيدا شنقا الصواني قطرة، أولا، وذلك باستخدام ماصة دليل، ونقل 300 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في 10 مل شكل أنبوب واحد في كل بئر من 4 × 24 جيدا تبلور pregreased الصواني.
   1. نقل 1 ميكرولتر من كل شرط تبلور من كل 300 ميكرولتر الخزان على سطح ساترة البلاستيك المقابلة التي تم إزالتها على حد سواء الأمامية والخلفية شرائط دعم وقائي.
   2. إلى ميكرولتر 1 من كل شرط تبلور إضافة 1 ميكرولتر من محلول البروتين تليها 0.5 ميكرولتر من مخزون البذور وضوح الشمس. عكس كل ساترة بحيث قطرة من السائل لأسفل والموقف أعلاه المناسبة أيضا.
   3. الصحافة أسفل على ساترة، ضغط sealiنانوغرام الشحوم وتشكيل ختم آمنة. مرة واحدة يتم وضع كل قطرات 96، ينبغي نقل علبة الى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة، عادة في حدود 4-18 درجة مئوية لمدة التخزين.
4. لإجراء فحص rMMS في الجلوس 96 جيدا صواني قطرة أولا نقل 20-50 ميكرولتر من كل حالة من 96 حالة الشاشة جيدا تبلور في شكل عميق كتلة جيدا في كل المقابلة بشكل جيد من الدرج التبلور. هذه الخطوة نقل يمكن أداؤها باستخدام الروبوت التبلور، أو عن طريق التحويل اليدوي باستخدام ماصة 8 قنوات.
   1. نقل الخزان والبروتين والبذور الحلول الأسهم إلى قطرات من جهة أو مع الروبوت باستخدام وحدات التخزين بالتفصيل في 3.1. بعض الروبوتات التبلور المتاحة تجاريا عدم الاتصال الاستغناء، وأداء البذور نقل المخزون باستخدام مثل هذا النظام قد يؤدي إلى انسداد الأنابيب الاستغناء نصائح او المرتبطة بها. ترتيب صرفها هو متغير: بعض الروبوتات الاستغناء عن الحلول في وقت واحد. إذاهذا غير ممكن، الاستغناء البروتين أولا، ثم الخزان، ثم البذور الأسهم.
   2. إذا كان الاتصال الاستغناء الروبوت ليس نقل متوفرة بذور باستخدام حقنة الزجاج انخفاض حجم مزودة إبرة حادة. شطف إبرة بتمريرها من خلال حل الخزان ثم الاستغناء عن مخزون البذور في كل قطرة.
   3. ختم صينية باستخدام ورقة ختم شفافة ونقل إلى حاضنة أو غرفة درجة حرارة ثابتة للتخزين.

4. التفتيش على بلورة الصواني

1. تصور كل التجارب تبلور باستخدام المجهر مجهر أو نظام التصوير الكريستال. السابق يتيح عموما تحكم المستخدم أكبر على عمق الرؤية ودرجة التكبير من هذا الأخير، ولكن هو أكثر استهلاكا للوقت.
2. تفتيش كل sub-well/coverslip في تسلسل وتسجيل أية أدلة على تشكيل الكريستال. يجب فحص التجارب مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة 5 أيام عقب إنشائها ون بعد ذلك مرة واحدة كل 7 أيام لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
3. غالبا ما يطلب من دورات متعددة من قبل rMMS يتم إنتاج بلورات الأمثل جودة الحيود.

النتائج

(A) مثال لتجربة rMMS

للتدليل على فعالية rMMS فحص طبقنا هذا الأسلوب لبلورة الدجاجة بيضة الليزوزيم الأبيض (HEWL) والكبد البقري الكاتلاز (BLC). كل من هذه الأنزيمات هي crystallizable بارز وهيكليا تتميز كذلك الأهداف ^{15 و 16.} على هذا النحو على حد سواء ...

Discussion

في هذه الورقة التي وصفناها طريقة عامة لrMMS بلورة البروتين الفرز. لقد أثبتنا باستخدام اثنين من البروتينات اختبار بزيادة كبيرة في معدل نجاح تبلور باستخدام هذا الأسلوب. تحليل حيود باستخدام الإشعاع السنكروتروني من مجموعة فرعية من بلورات إنشاؤها باستخدام rMMS وأساليب غير r...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0