Улучшение Шанс белка кристаллизации случайным Microseed Matrix скрининга

Резюме

Здесь мы опишем общий метод случайной microseed матрицы скрининга. Этот метод показан значительно увеличить шансы на успех белковых кристаллизации скрининга экспериментов, снизить потребность в оптимизации, а также обеспечить надежную поставку кристаллов для сбора данных и лиганд-купания экспериментов.

Аннотация

Случайное скрининг microseed матрица (РММС) представляет собой метод кристаллизации белка, в котором затравочные кристаллы добавлен в случайных экранов. Увеличивая вероятность того, что кристаллы будут расти в метастабильной зоны фазовой диаграммы белка, дополнительные провода кристаллизации часто получают, качество кристаллов, произведенных может быть увеличена, и хороший запас кристаллов для сбора данных и купания экспериментов обеспечивается. Здесь мы опишем общий метод РММС, которые могут быть применены к либо сидя падение или висит диффузии экспериментов пара падение, установленных вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 96-колодца или формате 24-а в трее.

Введение

С момента своего первоначального заявления Перутца, Кендрю с сотрудниками в определении структуры гемоглобина и миоглобина, к современным высокой пропускной автоматизированных трубопроводов структурной геномики консорциумов, макромолекулярный рентгеновской кристаллографии предоставил нам беспрецедентную структурную заглянуть в мире белка . Этот метод остается наиболее широко применяется экспериментальный метод, который позволяет прямой визуализации структуры белка в атомной, или около атомным разрешением (т.е. в диапазоне 1-3 Å). Предпосылкой для рентгеновской дифракции, которая будет применяться к белку в том, что оно должно быть сначала кристаллизуется, и именно это этап процесса, который остается самым крупным ограничение скорости шаг в определении структуры дифракционными методами ^{1, 2.} Несмотря на значительные успехи в понимании процесса кристаллизации белков, и значительные улучшения в качестве и доступности экранов кристаллизации,лотки, и связанные с ними технологии, остается невозможным достоверно предсказать вероятность успеха кристаллизации ^3. Биохимические и биофизические методы могут быть применены для оценки того белок процентных дисплеев благоприятные характеристики для зарождения кристаллов и роста, то есть это хорошо сложенный, однородная, монодисперсными и т.д., однако, эти знания ни в коей мере обеспечить окончательный предиктором кристаллизации склонность.

Посев уже давно якобы быть жизнеспособным способ улучшения количество, размер и качество существующих кристаллов или кристаллического материала ^4-7. Этот подход основан на том, что состояние, которое поддерживает зарождения кристаллов не может быть оптимальным для последующего роста кристаллов и наоборот. Передавая ядросодержащие материал из одного состояния в другое, можно попытаться эффективно отделить эти процессы, тем самым, предоставляя доступ к новым, еще неизведанные пространства кристаллизации,и в результате увеличения общего показателя успешности скрининга эксперимента. Штатные методы были зарегистрированы для (I) macroseeding, передача монокристалла во всей его полноте из одного состояния в другое ^8, (II) полоска посева, передача зародышевого материала, как правило, полученной путем применения направленного давления с использованием, например усов у кошки на поверхность существующей кристалла, а затем последующего прохождения минимальным через новый падения кристаллизации ^9, и (III) "классической" microseeding, передача Кристалл "семян", порожденных уборки раздавил кристаллы (или кристаллический материал), в условиях, сходных с теми, которые дали семенам ^10. Примечательно все три из этих методов требуют много времени и плохо масштабируемым, конечно по сравнению с тем, что это достижимо с современными робототехники кристаллизации обработки жидкостей. Эти факторы способствовали, в какой-то степени, по крайней мере, в восприятии, что семяIng является методом для посещения только тогда, когда другие подходы не смогли приносить свои плоды.

Случайная матрица microseeding (РММС) Недавнее методологическая инновация, которая сочетает в себе преимущества традиционного microseeding с тех скрининга высокой пропускной и масштабируемости ^11-13. Этот подход основан на генерации семенного материала, полученного из зародышевого кристаллического материала, который может быть аликвоты в / на каждой sub-well/coverslip в пределах стандартного экрана кристаллизации 96-условию. Этот метод применим к обоим сидя или висит пара падение диффузии эксперименты, установленные вручную или с использованием жидких робототехнику обработки, в 24-колодца или 96-луночного формата трее. РММС было продемонстрировано экспериментально значительно увеличить показатель успеха кристаллизации, и производят кристаллы повышения качества дифракции и количества ^{11, 13, 14,} и представляет собой инновационный инструмент в арсенале кристаллографы "подходов в оNgoing усилия на пути к успеху кристаллизации. Здесь мы опишем общий метод РММС и обеспечить образцы данных, иллюстрирующих эффективность этого метода.

протокол

1. Стратегические соображения

1. Выбор семенных кристаллов используется для microseeding экспериментов будет варьироваться в зависимости от целей эксперимента. В начале проекта было бы полезно, чтобы найти несколько хитов кристаллизации, которые могут обеспечить альтернативные отправные точки для оптимизации кристалла. РММС значительно снижает потребность в оптимизации кристаллической потому хорошего качества кристаллы, скорее всего, расти в метастабильной зоны фазовой диаграммы, т.е. в области, где следующие нарушения или зародышей система возвращается к равновесию. Поэтому мы предлагаем использовать РММС регулярно, как только первые кристаллы получаются (или, точнее, как только первые кристаллы перестают расти).
2. Для первого раунда РММС, семенной фонд должны быть сделаны с такой же кристаллического материала, как это возможно. Если только один хорошо доступен, который содержит кристаллы, или если кристаллы малы, это может быть полезно для создания нескольких повторенийОригинальный хит (без посева) увеличить поставки кристаллов. Если, однако, несколько различных показов получены, затравочные кристаллы могут быть собраны из нескольких условий и смешивают вместе.
3. Чтобы избежать разделения фаз, кристаллы, выращенные в условиях высокого соли должны быть собраны отдельно от кристаллов, выращенных в условиях высокого PEG. Если кристаллы из нескольких скважин смешивают, резервуар решение, менее вероятно, чтобы получить кристаллы соли должны быть выбраны для семян суспензии. Например, высокие концентрации фосфата, сульфата, кальция и магния следует избегать.
4. Позже в проекте может быть важно, чтобы искать кристаллов с различными единичными элементами, чтобы улучшить дифракции, избежать двойниковых кристаллов, и получени кристаллов, которые подходят для связывания лигандов. На этой стадии только наиболее подходящие кристаллы (например, те, которые лучше всего преломлять) должен быть использован, чтобы сделать семенного фонда. Иногда повторные раунды microseeding требуются, где только "лучший"Кристаллы используются для создания семенного фонда для последующего раунда. Если это возможно,« нейтральный »осадителем такие как ПЭГ 3000 следует использовать приостановить затравочных кристаллов в поощрять новые хрустальные контакты и кристаллизоваться комплексы, которые могут быть нестабильными в высокой -солевые растворы ^12.
5. Классические эксперименты microseeding, где используется одно условие кристаллизации, часто бывают полезны после выявления перспективной состоянии и во время последующей оптимизации. Часто бывает необходимо разбавить семенного фонда, чтобы получить желаемое количество кристаллов на капли. "Комбинаторным" microseeding эксперимент (где ряд семенных запасов увеличением разбавления добавляют в состоянии кристаллизации) представляет собой быстрый способ для поиска оптимального разбавление семенного материала. Этот подход описан ниже.

2. Подготовка семенного фонда

1. Сделать округлый стеклянный зонд из стекла пипетки Пастера с помощью пламени Бунзена.
   1. Нагрейте пипетку около середины, пока она не станет мягкой, а затем быстро снимите его с огня и оттянет, потянув за исключением концы. Цель вытащить стакан с диаметром менее 0,25 мм.
   2. Разбить стекло в точке, где она составляет около 0,25 мм и кратко окунуться сломанный конец в пламя. Повторите это, пока полусферы из стекла диаметром ~ 0,75 мм формируется на конце. Этот зонд полезно для дробления кристаллического материала, как это соответствующего размера для ударов твердых предметов на 0,01-1,0 мм масштабе и не повредить пластиковую поверхность кристаллизации лоток суб-колодца или покровное. Большие зонды (~ 1,0 мм) может раздавить маленькие кристаллы более эффективно, потому что кристаллы оказались в ловушке между стеклом и пластиком.
2. Поместите 1.5 мл микроцентрифужную пробирку, содержащую бисера на льду.
3. Проверьте заранее установленный лоток кристаллизации с помощью бинокулярного микроскопа или системы кристалл изображений и выберите один или несколько арpropriate скважин из лотка, из которого собрать кристаллический материал для производства семенного материала. Любой материал может быть использован в том числе тонких игл, сферолитов, микрокристаллов и нерегулярных, плохо образованных кристаллов. Семенной фонд должны быть сделаны как можно скорее после того, как кристаллы перестают расти, как старший материал, скорее всего, частично сшитый, тем самым уменьшая его пригодность для использования в посевных экспериментов. В случае каких-либо сомнений относительно того, кристаллический материал, чтобы быть собраны, является ли соль или белок вполне может быть визуализированы с помощью УФ-флуоресцентного микроскопа или систему формирования изображения перед открытием или кристаллический материал может быть подвергнут на месте рентгеновского дифракционного анализа в лоток. При использовании бывших кристаллы подход белка высветится под УФ-облучения, кристаллы соли появится бесцветным.
4. Откройте выбранный лоток кристаллизации хорошо. Для 96-а, сидя падение лотки прорезать верхней уплотнительной листа пластика вокруг выбранный хорошо USIнг лезвие скальпеля. Для 24-а лотки капля крови удалить покровное использованием пинцета. Обратить покровное и поместите его на устойчивую чистую поверхность. Удалить 50 мкл раствора резервуара и передавать эту жидкость в микроцентрифужных трубки, содержащей бисера обеспечение того, чтобы трубка остается на льду во всем.
5. Тщательно раздавить кристаллы в subwell (лоток 96-а) или покровного (лоток 24-а) падает, используя стеклянную зонд, подготовленный в разделе 2.1, просмотра результатов под микроскопом. Небольшие кристаллы может занять несколько минут, чтобы полностью подавить. Этот шаг позволяет экспериментатор, чтобы проверить, что кристаллы легко раздавить и поэтому не сшитый, а также, что они не являются кристаллы соли. Кристаллы соли производят характерный щелчок, который можно услышать и чувствовали, когда их будут бить. Если кристаллы жесткие и трудно подавить попытку получить и использовать свежий материал.
6. Удалить 5 мкл резервуара раствора из бисера трубки и тransfer до эквивалента к югу от скважины (сидя эксперимент капля), или покровное (висит эксперимент капля), содержащей кристаллический материал, чтобы быть собраны. Пипетки это жидкость вверх и вниз 5-6 раз для ресуспендирования столько содержимого суб-луночных или покровное насколько это возможно. Вернуться подвеску к бисера трубки и повторить этот шаг в два раза больше, гарантируя, что столько, сколько кристаллическое вещество собирали, как это возможно.
7. Вихря бисера в течение двух минут, останавливая каждые 30 сек, чтобы охладить пробирку на льду.
8. Сделать серийные разведения, разбавляя семенного фонда в резервуара раствора на коэффициент от 4 до 10 на каждом этапе. Как правило, слишком много кристаллы будут получены при использовании в неразбавленном семенной фонд, так что используйте разбавленные запасы семян, чтобы контролировать количество кристаллов на лунку. В первом туре РММС, важно, чтобы не разбавлять семян исходного раствора, так как чем больше концентрация семян тем больше хитов кристаллизации будут получены.
9. Если это не так, чтобы быть использованы немедленноленно, передать семенного подвеску и разбавленный семенного фонда к -20 ° С, или -80 ° C морозильник для хранения. Для предотвращения повторных циклов замораживания-оттаивания, которые могут снизить эффективность семенного фонда, хранить этот материал малыми порциями объему, т. е. 10-20 мкл. После того, как замороженные, запасы семян может храниться неограниченно долго, пока это необходимо.

3. Создание кристаллизации лотков

1. В зависимости от наличия кристаллизации объектов и предпочтений экспериментатора, РММС скрининг кристаллизации может быть выполнена с использованием либо лотки 24-а, использующие висит метод диффузии пара падение или лотки 96-а, используя сидя метод падение диффузии паров. Кристаллизация лотки для РММС может быть установлена ​​либо вручную, используя жидкость обработки робота дозатор, или сочетание того и другого.
2. Типичный РММС эксперимент настроить вручную будет состоять, 1,0 мкл раствора белка, 1,0 мкл состояние кристаллизации, и0,5 мкл семенной фонд. Типичный эксперимент настроить с помощью кристаллизации робота будет состоять, решение 0.3 мкл белка, 0,2 мкл состояние кристаллизации, и 0,1 мкл семенной фонд.
3. Для выполнения РММС скрининг в 24-луночные лотки висит падение, во-первых, с помощью ручного пипетки 300 мкл каждого условия с экрана условие кристаллизации 96-луночного в 10 мл формата одна трубка в каждую лунку 4 х 24-луночный pregreased кристаллизации лотки.
   1. Передача 1 мкл каждого условия кристаллизации из каждого резервуара 300 мкл на поверхность соответствующего пластического покровным из которых обе передние и задние защитную подложку полосы были удалены.
   2. К 1 мкл каждого условия кристаллизации добавить 1 мкл раствора белка с последующим 0,5 мкл кристаллов семенного фонда. Переверните каждый покровное такой, что падение жидкости обращенные вниз и положение выше соответствующая хорошо.
   3. Пресс вниз на покровное, сжимая sealiнг смазку и формирования безопасную печать. После того как все 96 капель установлено, лоток должны быть переданы в инкубаторе или постоянной комнатной температуре, обычно в диапазоне 4-18 ° С для хранения.
4. Для выполнения РММС скрининг в 96-луночный сидит лотки падение во-первых передавать 20-50 мкл каждого условия с экрана условие кристаллизации 96-луночного глубокого в формате блока а в каждую соответствующую лунку лотка кристаллизации. Этот шаг передачи могут быть выполнены с использованием либо кристаллизации робота, или путем ручного перевода с использованием 8-канальную пипетку.
   1. Водохранилище перевод, белковые и семенного решения капель вручную или с роботом с помощью объемов, описанные в 3.1. Некоторые имеющиеся в продаже роботы кристаллизации не пишите диспенсирования и исполнительская семенной фонд передачи с использованием такой системы может привести к закупорке дозирования советы, связанные трубки. Порядок выдачи варьируется: некоторые роботы обойтись все решения одновременно. Еслиэто невозможно, обойтись белок, а затем резервуар, то семенного фонда.
   2. Если контакт дозирования робота не доступна передача семена, используя стекло с низким объем шприца, снабженного тупой иглы. Промыть иглу, пропуская ее через водохранилище раствору затем обойтись семенного фонда в каждой капле.
   3. Закройте лоток, используя прозрачную уплотнительную лист и передать инкубаторе или постоянной комнатной температуре для хранения.

4. Инспекция кристаллизации лотков

1. Представьте все эксперименты кристаллизации, используя либо бинокулярный микроскоп или системы кристалл изображения. Бывший обычно дает пользователю больший контроль над глубиной просмотра и степень увеличения, чем вторые, но занимает больше времени.
2. Проверьте каждую sub-well/coverslip в последовательности и записать любое доказательство образования кристаллов. Эксперименты должны проверяться один раз каждые 24 ч в течение 5 дней после установления ин впоследствии раз в 7 дней на срок до 4 недель.
3. , Часто необходимы до оптимального качества дифракции кристаллов получают множество циклов РММС.

Результаты

(А) Пример эксперимента РММС

Чтобы продемонстрировать эффективность РММС скрининга мы применили этот метод для кристаллизации куриного яйца лизоцима (HEWL) и печени крупного рогатого скота каталазы (BLC). Оба эти ферменты в высшей кристаллизоваться и структурно охарактериз?...

Обсуждение

В этой статье мы описали общий метод РММС белка скрининга кристаллизации. Мы показали, используя два тестовых белков значительно усилены в успешности кристаллизации с помощью этого метода. Анализ дифракции с использованием синхротронного излучения подмножества кристаллов, полученн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0