Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Riepilogo

Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo.

Abstract

Lo screening matrice microseed casuale (RMM) è una tecnica di cristallizzazione della proteina in cui cristalli di semi vengono aggiunti agli schermi casuali. Aumentando la probabilità che i cristalli crescono nella zona metastabile del diagramma di fase di una proteina, contatti supplementari cristallizzazione si ottengono spesso, la qualità dei cristalli prodotti può essere aumentata, e una buona scorta di cristalli per esperimenti di raccolta dati e da bagno sono forniti. Qui si descrive un metodo generale per RMM che possono essere applicati a entrambi seduti goccia o appesi esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 24-ben 96 pozzetti o.

Introduzione

Dalla sua domanda iniziale da Perutz, Kendrew e collaboratori nel determinare le strutture di emoglobina e mioglobina, ai moderni ad alto rendimento condotte automatizzati di genomica strutturale consorzi, macromolecolare cristallografia a raggi X ci ha offerto uno scorcio strutturale senza precedenti nel mondo della proteina . Questa tecnica rimane il metodo sperimentale più ampiamente applicabile che permette la visualizzazione diretta della struttura delle proteine ​​a atomico, o vicino risoluzione atomica (cioè nell'intervallo 1-3 Å). Un prerequisito per diffrazione di raggi X da applicare a una proteina è che deve prima essere cristallizzato, ed è questa fase del processo che resta il solo grande fattore limitante nella determinazione della struttura con metodi di diffrazione ^{1, 2.} Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione del processo di cristallizzazione delle proteine, e notevoli miglioramenti nella qualità e disponibilità di schermi di cristallizzazione,vassoi e tecnologie correlate, resta impossibile prevedere in modo affidabile la probabilità di successo di cristallizzazione ^3. Metodi biochimici e biofisici possono essere applicati per valutare se una proteina di interesse display caratteristiche favorevoli per la nucleazione e la crescita di cristallo, cioè è ben piegato, omogenea, monodisperse, ecc, tuttavia, queste intuizioni in alcun modo fornire un predittore definitiva di cristallizzazione propensione.

Seeding è stato a lungo preteso di essere un metodo praticabile per migliorare il numero, le dimensioni e la qualità dei cristalli esistenti o di materiale cristallino ^4-7. Questo approccio si basa sul presupposto che una condizione che supporta cristallo nucleazione può non essere ottimale per la successiva crescita di cristalli e viceversa. Trasferendo materiale nucleate da una condizione all'altra, si può tentare di disaccoppiare efficacemente questi processi, dando così l'accesso al nuovo, ancora inesplorate spazio cristallizzazione,e di conseguenza aumentare il tasso di successo di un esperimento di screening. Metodi stabiliti sono stati documentati per (i) macroseeding, il trasferimento di un singolo cristallo in toto da una condizione all'altra ^8, (ii) realizzato semina, il trasferimento di materiale nucleati, generalmente ottenuta mediante l'applicazione di pressione direzionale utilizzando ad esempio baffo di un gatto alla superficie di un cristallo esistente, seguita da successivo passaggio del baffo attraverso una nuova cristallizzazione goccia ^9, e (iii) microseeding "classico", il trasferimento di cristallo "semi", generati dalla raccolta schiacciato cristalli (o cristallina materiale), in condizioni analoghe a quelle che hanno dato i semi ^10. In particolare tutti e tre questi metodi sono molto tempo e poco scalabile, certamente in confronto a ciò che è realizzabile con le moderne di gestione dei liquidi robotica cristallizzazione. Questi fattori hanno contribuito, in qualche modo, almeno, alla percezione che le sementiing è un metodo di essere visitato solo quando altri metodi non sono riusciti a dare i suoi frutti.

Microseeding matrice casuale (RMM) è una innovazione metodologica recente che combina i vantaggi di microseeding tradizionale con quelle di screening ad alto rendimento e scalabilità ^11-13. Questo approccio si basa sulla generazione di un archivio di sementi, prodotti a partire da materiale cristallino nucleate, che può essere frazionato in / su ciascun sub-well/coverslip all'interno di uno schermo di cristallizzazione 96-condizione standard. Questo metodo è applicabile sia seduto o appendere esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 96-ben 24 pozzetti o. RMM è stato dimostrato sperimentalmente per aumentare significativamente il tasso di successo di cristallizzazione, e produrre cristalli di una maggiore qualità e quantità ^{11, 13, 14} di diffrazione, e rappresenta uno strumento innovativo nell'arsenale dei cristallografi 'di approcci in ongoing sforzo verso il successo cristallizzazione. Qui si descrive un metodo generale per RMM e fornire dati di esempio che illustrano l'efficacia di questa tecnica.

Protocollo

1. Considerazioni strategiche

1. La scelta di semi-cristalli utilizzato per esperimenti microseeding varierà a seconda dell'obiettivo dell'esperimento. All'inizio di un progetto è utile per trovare diversi colpi di cristallizzazione che possono fornire punti di partenza alternativi per l'ottimizzazione di cristallo. RMM riduce notevolmente la necessità di ottimizzazione cristallo perché i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere nella zona metastabile del diagramma di fase, cioè nella regione in cui segue perturbazione o nucleazione il sistema ritorna all'equilibrio. È pertanto consigliabile utilizzare RMM ordinariamente non appena si ottengono i primi cristalli (o, più precisamente, non appena i primi cristalli smettere di crescere).
2. Per il primo giro di RMM, uno stock di semi dovrebbe essere fatto con tanto materiale cristallino possibile. Se solo un bene è disponibile che contiene cristalli, o se i cristalli sono piccoli, può essere utile per impostare più ripetizioni delhit originale (senza seeding) per aumentare l'offerta di cristalli. Se, tuttavia, diversi risultati si ottengono diversi, cristalli di semi possono essere raccolte da diverse condizioni e mescolati insieme.
3. Per evitare la separazione di fase, cristalli cresciuti in condizioni ad alto sale devono essere raccolte separatamente da cristalli cresciuti in condizioni di alta PEG. Se i cristalli di diversi pozzi sono mescolati, una soluzione serbatoio che è meno probabile che invia cristalli di sale dovrebbe essere selezionato per sospensione sementi. Ad esempio, elevate concentrazioni di fosfato, solfato, calcio e magnesio dovrebbero essere evitati.
4. Successivamente in un progetto, può essere importante cercare cristalli con pile unitarie differenti al fine di migliorare la diffrazione, evitare cristalli gemellate, ed ottenere cristalli che sono adatti per ligandi di legame. In questa fase solo i cristalli più adatti (ad esempio quelli che diffrangono meglio) dovrebbe essere usato per fare il brodo seme. A volte ripetuti cicli di microseeding sono tenuti, dove solo la "migliore"I cristalli sono usati per fare il brodo seme per il successivo round. Se possibile, un" precipitante neutrale ", come PEG 3000 deve essere utilizzato per sospendere i cristalli di semi di favorire i contatti cristallo nuovi e cristallizzare complessi che possono essere instabili in alto soluzioni ^saline-12.
5. Esperimenti microseeding classica, in cui viene utilizzato una sola condizione di cristallizzazione, sono spesso utili a seguito della individuazione di una condizione promettente e durante la successiva ottimizzazione. È spesso necessario diluire il porta-seme per ottenere il numero desiderato di cristalli a goccia. Un esperimento "combinatoria" microseeding (dove una serie di ceppi di crescente diluizione sono aggiunti ad una condizione di cristallizzazione) è un metodo rapido per trovare la diluizione ottimale dello stock di sementi. Questo approccio è descritto di seguito.

2. Preparazione del Seme della Fotografico

1. Fai una sonda di vetro arrotondato da una pipetta Pasteur di vetro utilizzando una fiamma Bunsen.
   1. Riscaldare la pipetta vicino al centro finché non diventa morbido, poi rimuovere rapidamente dal fuoco ed estrarlo staccando le estremità. Scopo di tirare il bicchiere di diametro inferiore a 0,25 mm.
   2. Rompere il vetro nel punto in cui è circa 0,25 mm ed brevemente immergersi fine rotto nella fiamma. Ripeti finchè una semisfera di vetro con un diametro di ~ 0,75 millimetri è formata sull'estremità. Questa sonda è utile per la frantumazione di materiale cristallino come è opportunamente dimensionato per urti con oggetti solidi su scala 0,01-1,0 mm e non danneggia la superficie di plastica di una cristallizzazione vassoio sub-bene o coprioggetto. Sonde più grandi (~ 1,0 millimetri) possono schiacciare i piccoli cristalli in modo più efficace perché i cristalli sono intrappolati tra il vetro e la plastica.
2. Mettere una provetta da 1,5 ml contenente un Seed Bead sul ghiaccio.
3. Ispezionare un vassoio di cristallizzazione prestabilita utilizzando un microscopio binoculare o sistema di imaging cristallo e selezionare uno o più appropriato pozzi dal vassoio da cui raccolgono materiale cristallino per ceppo generazione. Qualsiasi materiale può essere utilizzato compresi aghi sottili, sferuliti, microcristalli e irregolari, cristalli mal formati. Lo stock di sementi deve essere fatta al più presto possibile dopo i cristalli smettere di crescere, come materiale più vecchio è più probabile che sia parzialmente reticolata, riducendo così la sua idoneità per l'impiego in esperimenti di semina. In caso di dubbi sul fatto che il materiale cristallino per essere raccolto è sale o proteine ​​del pozzo può essere osservata con un microscopio a fluorescenza UV o sistema di imaging prima dell'apertura, o il materiale cristallino può essere sottoposto a in-situ analisi di diffrazione a raggi X nel vassoio. Quando si utilizzano gli ex cristalli proteici approccio sarà fluorescenza sotto irraggiamento UV, cristalli di sale appariranno incolore.
4. Aprire bene il vassoio di cristallizzazione selezionato. Per 96 pozzetti seduta vassoi goccia tagliare il foglio superiore di tenuta di plastica intorno al pozzetto selezionato USIng una lama da bisturi. Per i vassoi goccia appesa a 24 pozzetti rimuovere il vetrino con un paio di pinzette. Capovolgere il vetrino e posizionarlo su una superficie pulita stabile. Rimuovere 50 microlitri della soluzione di riserva e trasferire il liquido alla provetta contenente il Seme branello assicurare che il tubo rimane sul ghiaccio durante.
5. Schiacciare a fondo i cristalli in subwell (vassoio 96 pozzetti) o coprioggetto (vassoio 24 pozzetti) gocce, utilizzando la sonda vetro preparato in sezione 2.1, visualizzazione dei risultati sotto un microscopio. Piccoli cristalli possono richiedere diversi minuti per schiacciare a fondo. Questo passo permette lo sperimentatore di verificare che i cristalli sono facili da schiacciare e sono quindi non reticolate, e anche che non sono cristalli di sale. I cristalli di sale producono un caratteristico click che può essere ascoltato e sentito quando sono schiacciati. Se i cristalli sono duri e difficili da schiacciare cercare di ottenere e utilizzare materiale fresco.
6. Togliere 5 ml di soluzione di serbatoio dal tubo rocaille e transfer al sub-ben equivalente (seduta esperimento goccia), o coprioggetto (appeso esperimento goccia) contenente il materiale cristallino per essere raccolto. Pipettare questo liquido su e giù 5-6 volte per risospendere tanto del contenuto sub pozzetti o coprioggetto possibile. Riportare la sospensione al tubo rocaille e ripetere questo passaggio altre due volte, in modo che materiale cristallino quanto è raccolto il più possibile.
7. Agitare la rocaille per due minuti, fermandosi ogni 30 secondi per raffreddare la provetta in ghiaccio.
8. Effettuare una serie di diluizioni, diluendo lo stock di semi in soluzione serbatoio di un fattore di 4-10 in ogni fase. In genere, troppi i cristalli si ottengono quando si utilizza un ceppo non diluito, in modo da utilizzare le scorte di sementi diluito per controllare il numero di cristalli per bene. Nel primo turno di RMM, è importante non diluire la soluzione stock di sementi, in quanto maggiore è la concentrazione dei semi si ottengono le più colpi di cristallizzazione.
9. Se non deve essere utilizzato immediatamentetamente, trasferire la sospensione madre seme e il seme azione diluito ad una -20 ° C o -80 ° C per una conservazione. Per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento, che possono ridurre l'efficacia dello stock di sementi, conservare il materiale in piccole aliquote di volume, cioè 10-20 ml. Una volta congelate, le scorte di semi possono essere conservati a tempo indeterminato fino a quando necessario.

3. Istituzione di cristallizzazione vassoi

1. A seconda della disponibilità di strutture di cristallizzazione e le preferenze dello sperimentatore, lo screening cristallizzazione RMM può essere effettuata sia utilizzando i vassoi da 24 pozzetti che impiegano il metodo di diffusione del vapore goccia appesa o piatti a 96 pozzetti utilizzando il metodo di diffusione del vapore goccia seduta. Vassoi di cristallizzazione per RMM possono essere stabiliti sia a mano, utilizzando un liquido movimentazione dispenser robotizzato, o una combinazione dei due.
2. Un esperimento tipico RMM istituito dalla mano comprenderà, 1,0 ml soluzione proteica, 1,0 microlitri condizioni di cristallizzazione, e0,5 microlitri ceppo. Un tipico esperimento impostato utilizzando un robot di cristallizzazione comprenderà, soluzione proteica 0,3 ml, 0,2 ml condizioni di cristallizzazione, e 0,1 microlitri stock di semi.
3. Per eseguire lo screening RMM in 24 pozzetti appeso vassoi goccia, in primo luogo, con una pipetta manuale, trasferire 300 ml di ciascuna condizione da 96 pozzetti schermo condizione di cristallizzazione in 10 ml formato singolo tubo in ciascun pozzetto di 4 x 24 pozzetti cristallizzazione pregreased vassoi.
   1. Trasferire 1 ml di ciascuna condizione cristallizzazione da ciascun serbatoio 300 microlitri sulla superficie di un corrispondente coprioggetto di plastica da cui sono stati rimossi entrambi strisce di protezione protezione anteriori e posteriori.
   2. Per il 1 ml di ciascuna condizione di cristallizzazione aggiungere 1 ml di soluzione proteica seguiti da 0,5 ml di cristallo ceppo. Invertire ogni coprioggetto tale che la goccia di liquido è rivolta verso il basso e la posizione sopra la appropriata bene.
   3. Premere verso il basso sul vetrino, comprimendo la sealing grasso e formare una tenuta sicura. Una volta che tutti i 96 gocce sono stabiliti, il vassoio deve essere trasferito in un incubatore o camera a temperatura costante, di solito nell'intervallo 4-18 ° C per una conservazione.
4. Per eseguire lo screening RMM in 96 pozzetti seduta vassoi goccia in primo luogo trasferire 20-50 ml di ciascuna condizione da un 96-ben schermo condizione di cristallizzazione in formato profondità del blocco e in ciascun corrispondente pozzetto della piastra di cristallizzazione. Questa fase di trasferimento può essere eseguito utilizzando un robot cristallizzazione o un trasferimento manuale utilizzando una pipetta a 8 canali.
   1. Soluzioni stock serbatoio Transfer, proteine ​​e sementi verso le gocce a mano o con un robot utilizzando i volumi descritti in 3.1. Alcuni robot cristallizzazione disponibili in commercio non contattare dispense e performante semi di trasferimento di magazzino utilizzando un sistema del genere può causare il blocco di dispensare consigli o tubi associato. L'ordine di erogazione è variabile: alcuni robot dispensare tutte le soluzioni contemporaneamente. Sequesto non è possibile, a meno di proteine, poi serbatoio, poi ceppo.
   2. Se un contatto erogazione robot non è disponibile di trasmissione i semi utilizzando una siringa di vetro basso volume con ago smussato. Risciacquare l'ago passando attraverso la soluzione serbatoio poi dispensare il brodo seme in ogni goccia.
   3. Sigillare il vassoio con un foglio di sigillatura trasparente e trasferimento in un'incubatrice o una stanza a temperatura costante per la conservazione.

4. Ispezione di cristallizzazione vassoi

1. Visualizza tutti gli esperimenti di cristallizzazione utilizzando sia un microscopio binoculare o un sistema di imaging di cristallo. Che nel primo generalmente all'utente maggiore controllo sulla profondità di vista e il grado di ingrandimento di quest'ultimo, ma richiede più tempo.
2. Ispezionare ogni sub-well/coverslip in sequenza e registrare qualsiasi evidenza di formazione di cristalli. Gli esperimenti devono essere controllati una volta ogni 24 ore per 5 giorni successivi stabilimento e lan seguito, una volta ogni 7 giorni per un massimo di 4 settimane.
3. Cicli multipli di RMM sono spesso necessari prima di cristalli di qualità ottimale di diffrazione sono prodotti.

Risultati

(A) Esempio di un esperimento RMM

Per dimostrare l'efficacia dello screening RMM abbiamo applicato questo metodo per la cristallizzazione di gallina albume lisozima (HEWL) e del fegato bovino catalasi (BLC). Entrambi questi enzimi sono eminentemente cristallizzabile e sono strutturalmente obiettivi ^{15, 16} ben caratterizzati. Come tale entrambi forniscono ottimi soggetti di prova con cui illustrare il tasso di successo di cristallizzazione maggiore ottenibile con RMM. Esperimenti ...

Discussione

In questo articolo abbiamo descritto un metodo generale per lo screening RMM la cristallizzazione della proteina. Abbiamo dimostrato con due proteine ​​di prova di un aumento significativo nel tasso di successo di cristallizzazione con questo metodo. Analisi di diffrazione con radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli generati utilizzando RMM e metodi non RMM rivelato piccola variazione nella qualità di diffrazione tra i cristalli coltivati ​​utilizzando entrambi i metodi, anche se gli autori pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0