Améliorer le taux de réussite de cristallisation de protéines par hasard Microseed Matrice dépistage

Résumé

Nous décrivons ici une méthode générale pour le dépistage aléatoire de la matrice de microseed. Cette technique est illustrée à augmenter de manière significative le taux de dépistage des expériences de cristallisation de protéines de succès, de réduire le besoin pour l'optimisation, et de fournir un approvisionnement fiable de cristaux pour la collecte des données et expériences ligand-trempage.

Résumé

Aléatoire de dépistage de la matrice de microseed (RMM) est une technique de cristallisation de protéines dans lequel des cristaux de semences sont ajoutés aux écrans aléatoires. En augmentant la probabilité que les cristaux se développer dans la zone métastable du diagramme de phases d'une protéine, fils de cristallisation supplémentaires sont souvent obtenus, la qualité des cristaux obtenus peut être augmentée, et une bonne alimentation des cristaux pour les expériences de collecte de données et de trempage est fourni. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM qui peuvent être appliquées soit à goutte assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 96 puits ou format de plateau de 24 puits.

Introduction

De sa demande initiale par Perutz, Kendrew et collègues dans la détermination des structures de l'hémoglobine et la myoglobine, les haut débit pipelines modernes automatisés de la génomique structurale consortiums, macromoléculaire cristallographie aux rayons X nous a offert un aperçu structurel sans précédent dans le monde de la protéine . Cette technique reste le procédé le plus largement applicable expérimental qui permet la visualisation directe de la structure des protéines à atomique, ou à proximité de résolution atomique (c'est à dire dans la gamme de 1-3 Å). Une condition préalable à la diffraction des rayons X pour être appliqué à une protéine est qu'elle doit d'abord être cristallisé, et c'est cette étape du processus qui reste le plus grand pas unique limitant la vitesse dans la détermination de la structure par des méthodes de diffraction ^{1, 2.} Malgré des avancées significatives dans la compréhension du processus de cristallisation des protéines, et des améliorations majeures dans la qualité et la disponibilité des écrans de cristallisation,plateaux, et les technologies connexes, il reste impossible de prédire de façon fiable la probabilité de succès de cristallisation ^3. Méthodes biochimiques et biophysiques peuvent être appliqués pour déterminer si une protéine d'intérêt affiche des caractéristiques favorables pour la nucléation et la croissance cristalline, c'est à dire qu'il est ainsi pliée, homogène, monodisperse, etc, cependant, ces indications en aucun cas fournir un indicateur définitif de cristallisation propension.

L'ensemencement a longtemps été censé être une méthode viable pour améliorer le nombre, la taille et la qualité des cristaux existants ou matériau cristallin ^4-7. Cette approche est basée sur l'hypothèse qu'une condition qui favorise la nucléation des cristaux peut ne pas être optimal pour la croissance cristalline ultérieure et vice versa. En transférant le matériau nucléé d'un état à un autre, on peut tenter de découpler efficacement ces processus, donnant ainsi accès à un nouvel espace de cristallisation, encore inexploré,et par conséquent d'augmenter le taux de réussite globale d'une expérience de criblage. Méthodes établies ont été documentés pour (i) macroseeding, le transfert d'un monocristal dans son intégralité d'un état ​​à un autre ^8, (ii) l'ensemencement série, le transfert de matériau nucléé, généralement obtenu par l'application d'une pression directionnelle en utilisant par exemple la trichite d'un chat de la surface d'un cristal existant, suivi d'un passage ultérieur de la moustache grâce à une nouvelle goutte de cristallisation ^9, et (iii) microseeding "classique", le transfert de cristal «graines», générés par la récolte broyé cristaux (ou cristallin matériel), dans des conditions similaires à celles qui ont donné les graines ^10. Notamment tous les trois de ces méthodes sont longues et peu évolutive, certainement en comparaison à ce qui est réalisable avec la robotique moderne de cristallisation de manipulation des liquides. Ces facteurs ont contribué, à un certain niveau au moins, à la perception que les semencesING est une méthode pour être visité uniquement lorsque les autres approches ont échoué à porter ses fruits.

Aléatoire matrice microseeding (RMM) est une innovation méthodologique récente qui combine les avantages de microseeding traditionnelle avec ceux de criblage à haut débit et l'évolutivité ^11-13. Cette approche repose sur la génération d'un stock de semences, produit à partir de matière cristalline nucléée, qui peut être répartie dans / sur chaque sub-well/coverslip dans un écran de cristallisation 96 condition standard. Cette méthode est applicable à tous les deux assis ou suspendus expériences de diffusion de vapeur à goutte, établis à la main ou à l'aide de la robotique de manipulation des liquides, dans 24 puits ou format de plaque de 96 puits. RMM a été démontré expérimentalement à augmenter de manière significative le taux de réussite de cristallisation, et produire des cristaux de meilleure qualité et la quantité de diffraction ^{11, 13, 14,} et représente un outil novateur dans l'arsenal des cristallographes d'approches dans l'oNgoing effort vers la réussite de cristallisation. Nous décrivons ici une méthode générale pour RMM et fournissons des exemples de données illustrant l'efficacité de cette technique.

Protocole

Une. Considérations stratégiques

1. Le choix des semences cristaux utilisés pour des expériences de microseeding variera en fonction de l'objectif de l'expérience. Au début d'un projet, il est utile de trouver plusieurs coups de cristallisation qui peuvent fournir des points de départ de rechange pour l'optimisation de cristal. RMM réduit considérablement la nécessité pour l'optimisation de cristal car les cristaux de bonne qualité sont plus susceptibles de se développer dans la zone métastable du diagramme de phase, c'est à dire dans la région où après la perturbation ou la nucléation le système revient à l'équilibre. Nous suggérons donc d'utiliser RMM systématiquement dès que sont obtenus les premiers cristaux (ou, plus précisément, dès que les premiers cristaux cessent de croître).
2. Pour la première série de RMM, un stock de semences doit être faite avec autant de matière cristalline que possible. Si un seul bien est disponible qui contient des cristaux, ou si les cristaux sont petits, il peut être utile de mettre en place de multiples répétitions de lahit original (sans semis) pour augmenter l'offre de cristaux. Si, cependant, on obtient des résultats différents de plusieurs, des cristaux d'ensemencement peuvent être récoltées à partir de plusieurs conditions et mélangés ensemble.
3. Pour éviter une séparation de phase, les cristaux cultivés dans des conditions de haute teneur en sel doivent être récoltées séparément des cristaux cultivés dans des conditions de haute PEG. Si des cristaux à partir de plusieurs puits sont mélangés, une solution de réservoir qui est moins susceptible de donner des cristaux de sel doit être choisie pour la suspension d'ensemencement. Par exemple, des concentrations élevées en phosphate, sulfate, calcium et magnésium doivent être évités.
4. Plus tard, dans un projet, il peut être important de chercher des cristaux de différentes cellules de l'unité afin d'améliorer la diffraction, éviter cristaux jumelés, et obtenir des cristaux qui sont appropriés pour des ligands de liaison. A ce stade, seuls les cristaux les plus appropriés (par exemple ceux qui diffractent meilleur) devraient être utilisés pour faire le stock de semences. Parfois tours répétés de microseeding sont nécessaires, où seul le «meilleur"Cristaux sont utilisés pour faire le stock de semences pour le tour suivant. Si possible, une" précipitation neutre "tel que le PEG 3000 doit être utilisé pour suspendre les cristaux de semences pour encourager de nouveaux contacts de cristal et à cristalliser des complexes qui peuvent être instables en haut des solutions de ^sel-12.
5. Expériences de microseeding classique, où un état de cristallisation unique est utilisé, sont souvent utiles suite à l'identification d'une condition prometteuse et lors de l'optimisation ultérieure. Il est souvent nécessaire de diluer le stock de semences afin d'obtenir le nombre désiré de cristaux par goutte. Une expérience "combinatoire" de microseeding (où une série de stocks de semences de dilution croissante sont ajoutés à un état de cristallisation) est une méthode rapide pour trouver la dilution optimale du stock de semences. Cette approche est décrite ci-dessous.

2. Préparation de la semence Stock

1. Faire une sonde en verre arrondi d'une pipette Pasteur en verre à l'aide d'un bec Bunsen.
   1. Chauffer la pipette vers le milieu jusqu'à ce qu'elle devienne souple, puis retirez rapidement à partir de la flamme et le dessiner en tirant à part les extrémités. Objectif pour tirer vers le bas le verre à un diamètre inférieur à 0,25 mm.
   2. Briser le verre à l'endroit où il se situe autour de 0,25 mm et brièvement plonger l'extrémité cassée dans la flamme. Répéter ce jusqu'à ce qu'un hémisphère de verre d'un diamètre de ~ 0,75 mm est formé à l'extrémité. Cette sonde est utile pour concassage matériau cristallin comme il est de taille appropriée pour la suppression des objets solides à l'échelle 0,01-1,0 mm et ne pas endommager la surface plastique d'une cristallisation plateau sous-ou bien lamelle. Grandes sondes (~ 1,0 mm) peuvent écraser les petits cristaux plus efficace parce que les cristaux sont piégés entre le verre et le plastique.
2. Placez un tube de centrifugation de 1,5 ml contenant une graine perle sur la glace.
3. Inspecter un plateau de cristallisation pré-établie à l'aide d'un microscope binoculaire ou système d'imagerie de cristal et sélectionnez un ou plusieurs appropriées puits du plateau à partir de laquelle récoltent matériau cristallin pour la génération du lot de plants. Tout matériau peut être utilisé y compris fines aiguilles, sphérolites, microcristaux et irréguliers, des cristaux mal formés. Le stock de semences doit être effectué dès que possible après que les cristaux cessent de croître, comme matériau âgée est plus susceptible d'être partiellement réticulé, réduisant ainsi son aptitude à l'emploi dans les expériences d'ensemencement. En cas de doute quant à savoir si le matériau cristallin à récolter est un sel ou une protéine du puits peut être visualisé en utilisant un microscope à fluorescence UV ou d'un système de formation d'image avant l'ouverture, ou le matériau cristallin peut être soumis à in-situ de l'analyse par diffraction des rayons X. dans le bac. Lorsque vous utilisez les anciens cristaux de protéines d'approche sera fluorescence sous irradiation UV, les cristaux de sel apparaîtront incolore.
4. Ouvrez le plateau de cristallisation choisi bien. Pour 96 puits assis plateaux de chute couper à travers la feuille d'étanchéité supérieure en plastique autour du bien sélectionné USIng d'une lame de scalpel. Pour 24 puits plateaux de goutte suspendue enlever la lamelle à l'aide d'une paire de pinces. Inversez la lamelle et placez-le sur une surface propre stable. Retirer 50 pi de la solution de réservoir et de transférer ce liquide dans le tube à centrifuger contenant la perle de semences en sorte que le tube reste de la glace tout au long.
5. Écraser soigneusement les cristaux dans le subwell (bac 96 puits) ou lamelle (plateau de 24 puits) diminue, en utilisant la sonde de verre préparé dans la section 2.1, l'affichage des résultats sous un microscope. Petits cristaux peuvent prendre plusieurs minutes pour écraser complètement. Cette étape permet à l'expérimentateur de vérifier que les cristaux sont faciles à broyer et ne sont donc pas réticulé, et également qu'ils ne sont pas des cristaux de sel. Les cristaux de sel produisent un clic distinctif qui peut être entendu et ressenti quand ils sont écrasés. Si les cristaux sont durs et difficiles à broyer essayer d'obtenir et d'utiliser des matériaux plus frais.
6. Retirer 5 ul de la solution du réservoir à partir du tube de la perle de semences et transfert à la même sous-équivalent (assis expérience de la goutte), ou lamelle couvre-objet (suspendus expérience de la goutte) contenant le matériau cristallin à être récoltées. Introduire à la pipette ce liquide de haut en bas 5-6 fois pour remettre en suspension comme la plupart des sous-puits ou lamelle contenu que possible. Retour à la suspension de tube de perle de semences et répéter cette étape deux fois plus, veiller à ce que le maximum de matière cristalline est récolté que possible.
7. Vortex la perle de semences pendant deux minutes, l'arrêt toutes les 30 secondes pour refroidir le tube sur la glace.
8. Faites une série de dilution, la dilution du stock de graines dans une solution de réservoir par un facteur de 4 à 10 à chaque étape. En règle générale, trop de cristaux seront obtenus en utilisant un stock de semences non dilué, donc à utiliser les stocks de semences dilué pour contrôler le nombre de cristaux par puits. Au premier tour de RMM, il est important de ne pas diluer la solution stock de semences, car plus la concentration de graines les plus de coups de cristallisation seront obtenus.
9. Si ce n'est pas pour être utilisés immédiatementment, transférer le stock de semences suspension et le stock de semences dilué à -20 ° C ou -80 ° C congélateur pour le stockage. Pour éviter des cycles répétés de gel-dégel, ce qui peut réduire l'efficacité du stock de semences, entreposer ce produit dans de petites fractions de volume, c'est à dire 10-20 pi. Une fois congelés, les stocks de semences peuvent être conservées indéfiniment jusqu'à ce que nécessaire.

3. Création de cristallisation Plateaux

1. En fonction de la disponibilité des moyens de cristallisation et les préférences de l'expérimentateur, le criblage de cristallisation RMM peut être effectuée en utilisant soit des plateaux à 24 puits employant la méthode de diffusion en phase vapeur goutte suspendue, ou des plateaux à 96 puits en utilisant la méthode de la chute de la diffusion de vapeur assise. plateaux de cristallisation pour RMM peuvent être établis à la main, en utilisant un distributeur de manutention robotisé liquide, ou une combinaison des deux.
2. Une expérience typique de RMM mis en place par la main comprendra, 1.0 solution de protéine pi, 1,0 pi état de cristallisation, et0,5 pi stock de semences. Une expérience typique mis en place à l'aide d'un robot de cristallisation comprendra, solution de protéine de 0,3 pi, 0,2 pi état de cristallisation, et 0,1 semences pi actions.
3. Pour effectuer le dépistage des RMM dans 24 puits suspendus plateaux d'abandon, d'une part, à l'aide d'une pipette manuelle, transférer 300 pl de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation dans 10 ml de format de tube unique dans chaque puits de 4 x 24 puits cristallisation lubrifiées en usine plateaux.
   1. Transférer 1 ul de chaque condition de cristallisation dans chaque réservoir 300 pl sur la surface d'une lamelle couvre-objet en plastique correspondante à partir de laquelle les deux bandes de renfort de protection avant et arrière ont été enlevés.
   2. Pour les 1 pl de chaque condition de cristallisation ajouter 1 pl de solution de protéine suivie par 0,5 pi de cristal stock de semences. Inverser chaque lamelle couvre-objet de telle sorte que la goutte de liquide est orienté vers le bas et la position au-dessus du puits approprié.
   3. Appuyez vers le bas sur la lamelle, la compression de la Sealing graisse et formant un joint sûr. Une fois que toutes les gouttes 96 sont établis, le plateau doit être transféré à un incubateur ou une chambre à température constante, habituellement dans la gamme de 4 à 18 ° C pour le stockage.
4. Pour effectuer le dépistage des RMM dans 96 puits assis plateaux de déposer tout d'abord transférer 20-50 pi de chaque état de 96 puits écran état de cristallisation en format bloc de puits profond dans chaque puits correspondant du plateau de cristallisation. Cette étape de transfert peut être effectué en utilisant soit un robot de cristallisation, ou par un transfert manuel à l'aide d'une pipette à 8 canaux.
   1. réservoir de transfert, de protéines et de semences d'solutions aux gouttes à la main ou avec un robot en utilisant les volumes détaillés au paragraphe 3.1. Certains robots de cristallisation disponibles dans le commerce ne sont pas en contact distribution, et les graines de transfert d'actions performant utilisant un tel système peut entraîner un blocage de la distribution de conseil ou tuyauterie associée. L'ordre de distribution est variable: certains robots dispensent toutes les solutions simultanément. Sice n'est pas possible, passer la protéine d'abord, puis le réservoir, puis les stocks de semences.
   2. Si un contact de distribution de robot n'est pas disponible transfert des graines à l'aide d'une seringue en verre à faible volume munie d'une aiguille émoussée. Rincer l'aiguille en la faisant passer à travers la solution du réservoir, puis distribuer le stock de semences dans chaque goutte.
   3. Sceller le plateau à l'aide d'une feuille d'étanchéité transparent et le transférer à un incubateur ou une pièce à température constante pour le stockage.

4. Inspection de cristallisation Plateaux

1. Visualiser l'ensemble des expériences de cristallisation à l'aide soit d'un microscope binoculaire ou d'un système de formation d'image à cristal. L'ancien permet généralement à l'utilisateur plus de contrôle sur la profondeur de vue et le degré d'agrandissement de ce dernier, mais prend plus de temps.
2. Inspecter chaque sub-well/coverslip en séquence et enregistrer des preuves de la formation de cristaux. Les expériences doivent être inspectés une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours après l'établissement et lan puis une fois tous les 7 jours pour un maximum de 4 semaines.
3. Plusieurs cycles de RMM sont souvent nécessaires avant cristaux optimal de qualité de diffraction sont produites.

Résultats

(A) Exemple d'une expérience RMM

Pour démontrer l'efficacité du dépistage RMM nous avons appliqué cette méthode à la cristallisation de poule lysozyme d'oeuf blanc (HEWL) et foie de bovin catalase (BLC). Ces deux enzymes sont éminemment cristallisable et sont structurellement bien caractérisés des cibles ^{15, 16.} En tant que tel à la fois de fournir d'excellents sujets d'essai avec qui pour illustrer le taux de réussite de cristallisation accrue réalis...

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit une méthode générale pour RMM protéine dépistage de cristallisation. Nous avons démontré à l'aide de deux protéines de test un d'amélioration significative du taux de succès de la cristallisation en utilisant cette méthode. analyse de diffraction en utilisant le rayonnement synchrotron d'un sous-ensemble de cristaux générés en utilisant les RMM et les méthodes non-RMM a révélé peu de variation dans la qualité de diffraction entre les cristaux cultivés...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0