JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم عرض طريقتين التكميلية على أساس التدفق الخلوي والمجهري الذي تمكن من القياس الكمي، على مستوى خلية واحدة، لديناميات التعبير الجيني الناجم عن تفعيل مسار MAPK في الخميرة.

Abstract

الكمي في التعبير الجيني على مستوى خلية واحدة تكشف آليات تنظيمية الرواية تحجب في قياسات أجريت على مستوى السكان. يتم عرض طريقتين على أساس المجهري والتدفق الخلوي لشرح كيفية يمكن الحصول على هذه البيانات. ويستخدم تعبير مراسل الفلورسنت التي يسببها على تفعيل الأسمولية عالية الجلسرين MAPK المسار في الخميرة كمثال على ذلك. ويسلط الضوء على المزايا المحددة لكل طريقة. التدفق الخلوي يقيس عدد كبير من الخلايا (10،000) ويوفر مقياسا مباشرا لديناميات البروتين التعبير مستقلة عن حركية النضج البطيء للبروتين فلوري. التصوير من الخلايا الحية بواسطة المجهر هو على النقيض من ذلك تقتصر على قياس شكل نضجت لمراسل في خلايا أقل. ومع ذلك، يمكن للمجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذه التقنية أن تكون غنية للغاية وذلك بفضل لمجموعات من الصحفيين ومتعددة للمعلومات المكانية والزمانيةتم الحصول عليها من الخلايا الفردية. يمكن الجمع بين هذه الطرق قياس اثنين تقديم رؤى جديدة بشأن تنظيم بروتين تعبير عن طريق مسارات الإشارات.

Introduction

إشارة عبر أجهزة الطرد المركزي تنبيغ غالبا ما يتوج في التعبير عن البروتينات. توصيف هذا الملف التعبير هي عنصر أساسي في فهم وظيفة المسارات البيولوجية. لا يمكن أن يتحقق تحديد الطيف من التنظيم حتى البروتينات وديناميات التنشيط من خلال تقنيات مختلفة مثل المصفوفات الدقيقة، البقع أو البقع شمال غرب 1-3. ومع ذلك، يبلغ متوسط ​​هذه التقنيات الاستجابة شعب بأكمله من الخلايا. لفهم التنظيم غرامة من التعبير عن البروتينات، فمن المستحسن لجمع القياسات على مستوى خلية واحدة. من الناحية المثالية، ينبغي أن توفر هذه القياسات أيضا البيانات الكمية قابلة للتطوير النماذج الرياضية للمسار الأساسي.

المجهري والتدفق الخلوي هي اثنين من التقنيات، والتي هي مناسبة بشكل مثالي لتقديم مثل هذه القياسات وحيدة الخلية الكمي. وضع علامات الذاتية من البروتينات مع بروتين فلوري يمكن به تستخدم لقياس مستوى التعبير عنها 4. ومع ذلك، منذ إضافة شاردة الفلورسنت كبيرة في محطة من البروتين يمكن أن تجعل ذلك غير وظيفية، غالبا ما يكون أكثر من المرغوب فيه لتوليد صحفيين التعبير محددة تستند على المروج القيادة التعبير عن بناء الفلورسنت. هذا البروتين هو مراسل الخارجية لنظام الهاتف الخلوي، وبالتالي لا تؤثر على الأحداث يشير إلى أن تجري في الخلية.

كلا المجهري والتدفق الخلوي قد استخدمت على نطاق واسع في مجال الإشارات الخميرة. كأمثلة؛ كولمان، ليرنر وزملاء العمل المترابطة، في زنازين انفرادية، والتعبير عن التزاوج للصحفيين محددة وأعرب جوهري بواسطة المجهر لقياس الضوضاء في الخميرة التزاوج نقل الإشارة سلسلة 5، أكار وزملاؤه تستخدم التدفق الخلوي لدراسة الشبكة التنظيمية السيطرة على التعبير عن الجينات GAL 6. في دراسة سابقة 7، ونحن قد استخدمت تواليفعلى هذه التقنيات اثنين لدراسة الإخراج التعبير عن الأسمولية الجلسرين عالية (HOG) مسار في مهدها الخميرة. يتم تشغيل هذا mitogen تنشيط بروتين كيناز ([مبك]) الطريق بسبب الإجهاد المفرط الاسموزي. أنه يؤدي إلى تفعيل Hog1 MAPK التي translocates إلى نواة الخلية للحث على برنامج النسخي مما أدى إلى التعبير عن الجينات تقريبا 300. لدراسة هذه العملية، ونحن دبرت مراسل التعبير استنادا إلى المروج STL1 (الجينات المستحثة تحديدا ردا على النشاط Hog1 8) القيادة تعبير عن البروتين الفلوري الرباعي فينوس (ع STL1-QV). التدفق الخلوي القياسات كشفت وجود اثنين من السكان من الخلايا في مستوى التوتر المتوسط ​​(0.1 M كلوريد الصوديوم) مع جزء فقط من السكان معربا عن مراسل الفلورسنت. استخدمنا المجهري لمزيد من التحقيق في هذا السلوك، واكتشفت أن هذا الضجيج في تعبير البروتين وتحكمها العوامل الجوهرية 9. نحن فصول التوجيه الجامعيمزيد دينار نلاحظ أن الخلايا مع مستوى مماثل من النشاط Hog1 يمكن عرض نتائج التعبير افت للنظر مختلفة. مزيج من هذه التقنيات اثنين سمح لنا لشرح كيفية إعادة عرض بطء الاستجابة للضغط النفسي الجينات أثرت على نتيجة التعبير على مستوى خلية واحدة 7.

في هذه الورقة، ونحن نستخدم تعبير ع مراسل STL1-QV الناجم عن صدمة شديدة الاسموزي كمثال على القياس الكمي للبروتين التعبير بواسطة المجهر والتدفق الخلوي. ودرس نفس السلالة تتعرض ل0.2 M كلوريد الصوديوم الإجهاد مع كل التقنيات. وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على بعض الاختلافات الرئيسية في هذين التقنيات التكميلية للغاية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. المجهر القياسات

  1. تطعيم 5 مل من المتوسط ​​الاصطناعية مع الخميرة.
  2. تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية خلال الليل.
  3. قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.
  4. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD ​​600 0.05.
  5. تنمو ثقافة المخفف عند 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة.
  6. إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية.
  7. يعد حل 1 ملغ / مل من كونكانافالين A (كونا) في برنامج تلفزيوني.
  8. رشاحة ~ 200 ميكرولتر من الحل CONA في الشريحة جيدا.
  9. اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة.
  10. إزالة حل CONA.
  11. إضافة 150 ميكرولتر H 2 O إلى البئر.
  12. إزالة H 2 O.
  13. قياس OD 600 من ثقافة الخلية.
  14. إعداد 300 ميكرولتر من خلية ثقافة في OD 600 = 0.02 في 1.5 مل microtube.
  15. يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية.
  16. دوامة لفترة وجيزة ميلcrotube.
  17. يصوتن الخلايا في حمام مائي لمدة 45 ثانية.
  18. دوامة لفترة وجيزة microtube.
  19. إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى البئر.
  20. انتظر 30 دقيقة للسماح للخلايا تستقر في قاع البئر.
  21. وضع الشريحة على المجهر جيدا.
  22. حدد إعدادات الإضاءة الفلورسنت للقناة ليتم تسجيلها.
  23. حدد إعدادات الإضاءة لصورتين حقل مشرق (واحد قليلا من التركيز: 3 ميكرون أدناه البؤري للسماح لتجزئة السليم للخلايا).
  24. تحديد فترات زمنية لقياس الوقت الفاصل
  25. تحديد الحقول من أجل الصورة.
  26. بدء اقتناء عدد قليل من الإطارات.
  27. وقفة اقتناء لإضافة 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسط.
  28. استئناف التصوير.

2. تدفق الخلوي القياسات

  1. تطعيم 5 مل من المتوسط ​​الاصطناعية مع الخميرة.
  2. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية خلال الليل.
  3. التدبيروOD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها في صباح اليوم التالي.
  4. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها في 5 مل المتوسطة الاصطناعية لOD ​​600 0.1.
  5. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة للتوصل الى OD 600 من 0.2-0.4.
  6. إعداد الحل سيكلوهيكسيميد 1 ملغ / مل في H 2 O.
  7. إعداد 3 أضعاف تتركز (0.6 M) كلوريد الصوديوم الحل في المتوسطة الاصطناعية.
  8. إعداد واحد microtube 1.5 مل مع 100 ميكرولتر من 0.6 M كلوريد الصوديوم المتوسطة لكل نقطة زمنية المراد قياسها.
  9. في الوقت 0، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى كل microtube.
  10. احتضان مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية.
  11. في الوقت T، إضافة 30 ميكرولتر سيكلوهيكسيميد إلى microtube.
  12. كرر الخطوة 2.11 لجميع النقاط الوقت المطلوب.
  13. احتضان جميع microtubes لمدة 45 دقيقة على الأقل وحتى 3 ساعة على 30 درجة مئوية مع الهز.
  14. إعداد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 400 ميكرولتر PBS.
  15. يصوتن الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة.
  16. دوامة لفترة وجيزة microtubes.
  17. ابنicate الخلايا في حمام الماء لمدة 1 دقيقة.
  18. دوامة لفترة وجيزة microtubes.
  19. إضافة 100 ميكرولتر من خلية ثقافة كل microtube إلى المقابلة أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية لها.
  20. حدد 488 نانومتر ليزر الإثارة و530/30 نانومتر تصفية ممر الموجة للكشف.
  21. اختبار عدم التعبير عن ومعربا عن كامل عينة للتحقق مما إذا كانت تقع في نطاق حساسية كاشف.
  22. قياس 10،000 الخلايا لكل عينة المكتسبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

المجهر

كانت تعلق خلايا الخميرة تحمل مراسل التعبير ع STL1-QV (ySP9 7) إلى الجزء السفلي من الشريحة جيدا ووضعها تحت المجهر. وقد حفز الخلايا بإضافة التوتر المتوسط ​​مباشرة في البئر أثناء الدورة التصوير. وهذا يسمح لنا للحصول على ع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المجهر

علاج بشكل جيد مع CONA هو خطوة أساسية لضمان التصوير السليم للخلايا. لأن CONA ديه قدرة منخفضة على الذوبان في برنامج تلفزيوني (5 ملغ / مل)، يسمح للعملية الترشيح إزالة الركام الكبيرة التي تكون موجودة في الحل غير المرشحة وتتداخل مع الت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر ماتياس بطرس وجماعته في معهد الكيمياء الحيوية في ETH في زيوريخ حيث تم تطوير هذه الأساليب. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Yeast Nitrogen BaseForMediumCYN6202
CSM amino-acid mixForMediumDCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
CycloheximideFluka Aldrich SigmaC7698Toxic
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
MicroscopeNikonTi-Eclipse
Microscope control softwareMicro-managerVer 1.4.11
Incubation chamberLISThe Box
Fluorescence light sourceLumencorSpectraX
CameraHamamatsuFlash 4.0
Flow cytometerBDFACS calibur
Sonicator bathTelesonicTUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek155409
96-well-plateMatrical bioscienceMGB096-1-2-LG
FACS tubeBD Falcon352054

References

  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
  3. Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  4. Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
  5. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  6. Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
  7. Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
  8. de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
  11. Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100(2006).
  12. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).
  13. Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
  14. Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
  15. Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
  16. Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

80 MAPK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved