Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Özet

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Özet

Tek hücre düzeyinde gen ifadesinin miktar nüfus düzeyinde gerçekleştirilen ölçümler gölgede yeni düzenleme mekanizmalarını ortaya çıkarır. İki yöntem mikroskopi dayalı ve akım sitometri gibi veriler elde edilebilir nasıl göstermek için sunulmaktadır. Mayada, ozmotik basıncı yüksek gliserol MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan bir flüoresan raportör ekspresyonu, bir örnek olarak kullanılmıştır. Her bir yöntemin özel avantajları vurgulanır. Sitometrisi hücrelerin geniş bir sayısı (10,000) büyüklüğüne ve floresan proteinin yavaş olgunlaştırma kinetik bağımsız protein ifade dinamikleri doğrudan bir ölçümünü sağlar akış. Mikroskobu ile canlı hücrelerin Imaging az hücrelerinde raportör olgunlaşmış formunun ölçümü ile sınırlı aksine gereğidir. Ancak, bu teknikle üretilen veri setleri birden gazetecilere kombinasyonları ve mekansal ve zamansal bilgiler son derece zengin sayesinde olabilirtek tek hücrelerden elde. Bu iki ölçüm yöntemlerinin kombinasyonu sinyal yolları ile protein ifadesinin düzenlenmesinde yeni anlayışlar sunabilirsiniz.

Giriş

Sinyal transdüksiyon cascades ile genellikle proteinlerin ekspresyonu son bulur. Bu ifade profilinin karakterizasyonu biyolojik yollarının işlevini anlamada önemli bir unsurdur. Up-regüle proteinler ve bunların aktivasyon dinamikleri spektrumunun tanımlanması, bu tür mikro-dizileri, kuzey ya da batı lekeleri blotlar ^1-3 gibi çeşitli teknikler ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bu teknikler arasında, hücreler bütün bir nüfusun ortalama tepki. Protein ekspresyonunun ince düzenleme anlamak için, tek hücre düzeyinde ölçümleri toplamak için tercih edilir. İdeal olarak, bu ölçümler de altta yatan yolun matematiksel modeller geliştirmek için uygun nicel veri sağlamalıdır.

Mikroskopi ve akış sitometri ideal gibi nicel tek hücre ölçümlerini sunmak için uygundur iki teknik vardır. Bir floresan protein ile proteinlerin endojen etiketleme be ekspresyon seviyesi ⁴ ölçmek için kullanılır. Proteinin terminalinde büyük bir floresan yarımının eklenmesi işlevsel olmayan işlemek için Bununla birlikte, bu bir floresan yapısının ekspresyonunu tahrik eden bir promotere göre belirli ifade muhabir oluşturmak için genellikle daha fazla tercih edilir. Bu, raportör protein hücresel sistem için dışsal ve bu nedenle hücre içinde yer alıyor sinyal olaylarını etkilememektedir.

Mikroskopi ve akış sitometrisi her ikisi yaygın olarak maya sinyal alanında kullanılmıştır. Örnek olarak, Colman-Lerner ve arkadaşları korelasyon, tek hücreler içinde, maya eşleşme sinyal iletim ⁵ gürültüyü ölçmek için mikroskopi ile spesifik ve yapısal olarak ifade edilen muhabir çiftleşme ifade Acar ve düzenleyici ağ incelemek için akış sitometrisi el arkadaşları GAL genlerin ⁶ ekspresyonunu kontrol etmektedir. Önceki bir çalışmada ^7'de, bir combinati kullandıkozmotik basıncı yüksek gliserol maya tomurcuklanma olarak (HOG) yolunun gelen ifade çıkışını incelemek için bu iki teknikleri üzerine. Bu, mitojen tarafından aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu hiper-osmotik stres tarafından tetiklenir. Bu, yaklaşık 300 genlerin ekspresyonu ile sonuçlanan bir transkripsiyon programı indükleme hücrenin çekirdeğine doğru Hog1 MAPK aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu işlemi incelemek için, bir dört Venus floresan proteini (p-STL1 QV) ekspresyonunu tahrik STL1 promoteri (Hog1 aktivitesi ^8'e yanıt olarak, özellikle kaynaklı bir gen) dayanan bir sentezleme raportör mühendisliği vardı. Ölçümler, flüoresan raportör ifade nüfusun sadece bir kısmı ile orta gerilim seviyesinde (0.1 M NaCl) ile iki hücre popülasyonlarının varlığını ortaya sitometrisi akış. Biz daha bu davranışı araştırmak için mikroskobu kullandılar ve protein ifadesindeki bu gürültü içsel faktörlere ⁹ tabi olduğunu keşfetti. Biz could ayrıca Hog1 aktivite benzer bir düzeyde olan hücreler çarpıcı farklı ifade sonuçlarını görüntülemek verebilecek görüyoruz. Bu iki tekniğin kombinasyonu bize stres yanıtı genlerinin yavaş yeniden tek hücre düzeyinde ⁷ de ifade sonucunu nasıl etkilediğini göstermek için izin verdi.

Bu yazıda, mikroskobu ile protein ifade miktarının bir örnek olarak hiper-ozmotik şok tarafından uyarılan p STL1-QV muhabiri ifadesini kullanın ve akım sitometri. 0.2 M NaCl strese maruz aynı gerilme hem tekniklerle incelenmiştir. Bu bize bu iki derece tamamlayıcı teknikler arasındaki bazı temel farklılıkları vurgulamak için izin verecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. Mikroskopi Ölçümler

1. Maya sentetik ortam 5 ml inoküle.
2. Gece boyunca 30 ° C'de hücreler büyür.
3. Ertesi sabah, gece boyunca kültürün OD ₆₀₀ ölçün.
4. ₆₀₀ 0.05 OD 5 ml sentetik kültür ortamı içinde bir gece boyunca seyreltin.
5. En az 4 saat boyunca 30 ° C'de seyreltilmiş kültür büyütün.
6. Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi.
7. PBS, Concanavalin A (ConA) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın.
8. Süzüntü ~ iyi slayt içine ConA'nın çözeltisi 200 ul.
9. 30 dakika bekletin.
10. ConA'nın çözüm çıkarın.
11. De 150 ul H ₂ O ekleyin.
12. H ₂ O. kaldır
13. Hücre kültürü OD ₆₀₀ ölçün.
14. 1.5 ml = 0.02 mikrotüp içinde OD ₆₀₀ hücre kültürünün 300 ul hazırlayın.
15. 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon.
16. Vortex kısaca microtube.
17. 45 saniye için bir su banyosu içinde hücreleri sonikasyon.
18. Kısaca Vortex Mikrotüp.
19. Oyuğuna hücre kültürünün 200 ul ekleyin.
20. Hücreler kuyunun dibine çöker izin 30 dakika bekleyin.
21. Mikroskop iyi slayt yerleştirin.
22. Kaydedilecek floresan kanal aydınlatma ayarlarını seçin.
23. (: Hücrelerinin uygun bir segmentasyon sağlamak için odak düzleminin altında 3 um biraz odak dışında biri) iki parlak bir alan görüntüler için aydınlatma ayarlarını seçin.
24. Time-lapse ölçümü için zaman aralıklarını seçin
25. Görüntü görüş alanları seçin.
26. Bir kaç kare alımı başlatabilirsiniz.
27. 0.6 M NaCl ortamında 100 ul eklemek için satın Pause.
28. Görüntüleme Devam.

2. Sitometrisi Ölçümler

1. Maya sentetik ortam 5 ml inoküle.
2. Gece boyunca 30 ° C'de büyür.
3. TedbirOD, gece boyunca kültürün ₆₀₀ ertesi sabah.
4. ₆₀₀ 0.1 OD 5 ml sentetik bir ortam içinde bir gece boyunca kültür seyreltin.
5. OD 0,2-0,4 ₆₀₀ ulaşmak için en az 4 saat boyunca 30 ° C'de büyür.
6. _H2O içinde sikloheksimid çözelti 1 mg / ml hazırlanması
7. Hazırlama 3 kat sentetik aracı madde içinde (0.6 M) NaCl solüsyonu konsantre edildi.
8. Ölçülecek her zaman noktası için 0.6 M NaCl ortamın 100 ul bir 1.5 ml mikrotüp hazırlayın.
9. 0 zamanında, her bir mikrotüp hücre kültürü 200 ul ekleyin.
10. 30 ° C'de çalkalayarak kuluçkalayın
11. T süresi de, bir mikrotüpe 30 ul sikloheksimid ekleyin.
12. Her istenilen zaman noktaları için adımı 2.11 tekrarlayın.
13. En az 45 dakika boyunca tüm mikrotüpler inkübe edin ve çalkalanarak 30 ° C'de 3 saat kadar.
14. 400 ul PBS ile FACS tüpleri hazırlayın.
15. 1 dakika süre ile bir su banyosunda sonikasyon hücreleri.
16. Kısaca Vortex mikrotüpler.
17. Oğlum1 dakika boyunca bir su banyosu içinde hücreleri TARĐHĐ BELGE.
18. Kısaca Vortex mikrotüpler.
19. Her mikrotüpünden olarak karşılık gelen FACS tüpüne 100 ul hücre kültürü ekleyin.
20. Tespiti için 488 nm uyarma lazer ve 530/30 nm band geçiren filtre seçin.
21. Testi olmayan ifade ve tam onlar dedektör hassasiyet aralığında düşüş olmadığını doğrulamak için örnek ifade.
22. Alınan her bir örnek için 10,000 hücre ölçün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Mikroskopla inceleme

Sentezleme raportör p STL1-QV (ySP9 ⁷⁾ taşıyan maya hücreleri iyi slaydın tabanına bağlanmış ve mikroskop altında yerleştirildi. Hücreler görüntüleme oturumu sırasında doğrudan kuyuya stres ortamının eklenmesi ile uyarıldı. Bu bize yol indüksiyon öncesi hücrelerin birkaç görüntü elde ve stimülasyon sonrasında kendi kaderini takip sağlar. Bu durumda, hücreler, 10 dakika bir zaman aralığı ile ~ 2 saat boyunca takip edild...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Mikroskopla inceleme

ConA ile kuyunun tedavisi, hücrelerin uygun bir görüntüleme sağlamak için önemli bir adımdır. ConA PBS (5 mg / mi) içinde düşük bir çözünürlüğe sahip olduğundan, filtreleme işlemi sağlar: filtre çözelti içinde mevcut olan ve görüntüleme müdahale büyük agregaların çıkarılması. Hücreler, işlemden geçirilen yüzeye bağlı olarak güçlü bir şekilde tutunur ve uyaran çözeltisinin eklenmesinin uyaran önce ve sonra, bir sürekli izleme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054