Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

Serge Pelet; Delphine Aymoz; Eric Durandau

doi:10.3791/50637

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

DOI:

10.3791/50637

⸱

October 4th, 2013

Serge Pelet¹, Delphine Aymoz¹, Eric Durandau¹

¹Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.

Аннотация

Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.

Введение

Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки ^1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели базового пути.

Микроскопия и проточной цитометрии две методики, которые идеально подходят для доставки таких количественных измерений одной ячейки. Эндогенный мечение белков с флуоресцентным белком может бе используется для количественной оценки их уровня экспрессии ^4. Однако, так как добавление большого флуоресцентного фрагмента в конце белка может сделать его нефункциональным, часто более желательны, чтобы генерировать определенные репортеров экспрессии на основе промотора движущей экспрессию флуоресцентного конструкции. Этот репортер белок экзогенными для сотовой системы и, следовательно, не влияет на сигнальные события, которые происходят в клетке.

Оба микроскопии и проточной цитометрии были широко использованы в поле сигнализации дрожжей. В качестве примеров; Колман-Лернер и его коллеги коррелирует, в одиночных камерах, выражение спаривания конкретные и конструктивно, высказанные журналистам с помощью микроскопии для количественной оценки шума в дрожжи спаривания передачи сигнала каскада ^5, Акар и его коллеги использовали проточной цитометрии для изучения нормативно-сеть контролирующий экспрессию генов GAL ^6. В предыдущем исследовании ^7, мы использовали combinatiна этих двух методов для изучения выход экспрессии с высокой осмолярности глицерина (HOG) тропа в почкующихся дрожжей. Это митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути инициируется гипер-осмотического стресса. Это приводит к активации MAPK Hog1, который перемещает в ядро клетки, чтобы вызвать программу транскрипции, что приводит к экспрессии примерно 300 генов. Для изучения этого процесса, мы инженерии выражения репортера на основе STL1 промоутер (гена индуцируется в частности, в ответ на Hog1 деятельности ⁸⁾ движущей выражение четырехместном Венеры флуоресцентного белка (р STL1-см.). Проточной цитометрии измерения обнаружили наличие двух популяций клеток на среднем уровне напряжения (0,1 М NaCl) и только часть населения, выражающей флуоресцентного репортера. Мы использовали микроскопию для дальнейшего расследования это поведение и обнаружил, что этот шум в экспрессии белка регулируется внутренними факторами ^9. Мы CoUл.д. далее заметить, что клетки с аналогичным уровнем Hog1 деятельности может отображать поразительно разные результаты экспрессии. Сочетание этих двух методов позволило нам продемонстрировать, как медленно ремоделирования генов стресс-ответа повлияло на исход выражение в одном уровне клетки ^7.

В данной работе мы используем выражение р STL1-QV репортера, вызванного гипер-осмотического шока в качестве примера количественной оценки экспрессии белка по микроскопии и проточной цитометрии. Этот же штамм подвергается 0,2 М NaCl стресса изучали с обоих методов. Это позволит нам выделить несколько ключевых различия в этих двух весьма дополнительных методов.