La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

Serge Pelet; Delphine Aymoz; Eric Durandau

doi:10.3791/50637

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Resumen

Dos métodos complementarios basados en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

Resumen

La cuantificación de la expresión génica a nivel de células individuales descubre nuevos mecanismos de regulación oscurecidas en las mediciones realizadas a nivel de población. Se presentan dos métodos basados en la microscopía y citometría de flujo para demostrar cómo se pueden adquirir esos datos. La expresión de un indicador fluorescente inducida tras la activación de la alta osmolaridad MAPK vía de glicerol en la levadura se utiliza como un ejemplo. Se destacan las ventajas específicas de cada método. La citometría de flujo mide un gran número de células (10.000) y proporciona una medida directa de la dinámica de la expresión de la proteína independiente de la cinética lenta maduración de la proteína fluorescente. Obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía es por el contrario limitado a la medición de la forma madurado del reportero en un menor número de células. Sin embargo, los conjuntos de datos generados por esta técnica pueden ser extremadamente rico gracias a la combinación de varios periodistas ya la información espacial y temporalobtenido a partir de células individuales. La combinación de estos dos métodos de medición puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de la expresión de proteínas por las vías de señalización.

Introducción

La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western ^1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal sería que estas medidas también deben proporcionar datos cuantitativos susceptibles de desarrollar modelos matemáticos de la vía subyacente.

Microscopía y citometría de flujo son dos técnicas, que son ideales para ofrecer este tipo de mediciones cuantitativas de células individuales. El etiquetado endógena de proteínas con una proteína fluorescente puede be utilizado para cuantificar su nivel de expresión ^4. Sin embargo, ya que la adición de un resto fluorescente grande en la parte terminal de la proteína puede hacer que no sea funcional, a menudo es más deseable generar reporteros de expresión específicos basados en un promotor que dirige la expresión de una construcción fluorescente. Esta proteína indicadora es exógeno al sistema celular y por lo tanto no influye en los eventos de señalización que están teniendo lugar en la célula.

Tanto la microscopía y citometría de flujo han sido ampliamente utilizados en el campo de la señalización de la levadura. Como ejemplos, los compañeros de trabajo-Colman Lerner y correlacionados, en celdas individuales, la expresión de apareamiento periodistas específicos y constitutivamente expresadas por microscopía de cuantificar el ruido en el apareamiento de levadura de transducción de señales en cascada ^5, Acar y sus colegas utilizaron citometría de flujo para el estudio de la red de regulación el control de la expresión de los genes GAL ^6. En un estudio anterior ^7, hemos utilizado un combinatien una de estas dos técnicas para estudiar la salida de la expresión de la alta osmolaridad de glicerol (HOG) y la vía de levadura en ciernes. Esta proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) es provocada por el estrés hiper-osmótica. Es el resultado de la activación de las MAPK Hog1, que se transloca al núcleo de la célula para inducir un programa transcripcional que resulta en la expresión de aproximadamente 300 genes. Para estudiar este proceso, habíamos diseñado un reportero de expresión basado en el promotor STL1 (un gen inducido específicamente en respuesta a la actividad Hog1 ⁸⁾ que dirige la expresión de una proteína fluorescente Venus cuádruple (p STL1-qV). La citometría de flujo mediciones revelaron la presencia de dos poblaciones de células en el nivel de la tensión intermedia (NaCl 0,1 M) con sólo una fracción de la población que expresa el indicador fluorescente. Se utilizó microscopía de investigar más a fondo este comportamiento y descubrimos que este ruido en la expresión de proteínas se rige por factores intrínsecos ^9. Nos COUld observan, además, que las células con un nivel similar de actividad Hog1 podrían mostrar resultados sorprendentemente diferentes de expresión. La combinación de estas dos técnicas nos ha permitido demostrar cómo la lenta remodelación de genes de respuesta al estrés influyó en el resultado de expresión a nivel de células individuales ^7.

En este trabajo, utilizamos la expresión de la p-STL1 qV reportero inducida por choque hiper-osmótica como un ejemplo de la cuantificación de la expresión de proteínas por microscopía y citometría de flujo. La misma cepa sometida a estrés 0,2 M de NaCl se estudió con ambas técnicas. Esto nos permitirá poner de relieve algunas diferencias clave en estas dos técnicas altamente complementarias.