معطفا البذور الفراش الفحص لاستكشاف وراثيا<em&gt; في المختبر</em&gt; كيف إنبات البذور في الضوابط السويداء<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em

Summary

نقدم الإجراء لتجميع البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) من بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana. وقد أظهرت SCBA أن تكون أداة قوية لاستكشاف وراثيا في المختبر وكيفية إنبات البذور الضوابط السويداء في البذور نائمة واستجابة لمنبهات الضوء. وSCBA هو من حيث المبدأ المعمول بها تحت أي الحالة التي يشتبه السويداء على التأثير في النمو الجنيني.

Abstract

يتكون السويداء نبات الأرابيدوبسيس من طبقة وحيدة الخلية المحيطة الجنين ناضجة ويلعب دورا أساسيا لمنع إنبات البذور نائمة أو أن البذور nondormant المشع من قبل الحمراء بعيدة (FR) نبض الضوء. من أجل مزيد من التبصر في الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء النشاط القمعية الإنبات بواسطة السويداء المبذولة، وقد وضعت "البذور الفراش معطف" مقايسة (SCBA). وSCBA هو إجراء تشريح فصل جسديا معاطف البذور والأجنة من البذور، والتي تسمح بمراقبة نمو الأجنة على طبقة الأساسية من المعاطف البذور. بشكل ملحوظ، وSCBA reconstitutes الأنشطة القمعية إنبات البذور معطف في سياق سكون البذور والسيطرة FR-تعتمد على إنبات البذور. منذ SCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، وnondormant المعدلة وراثيا معطف البذور والمواد الجنينية، مسارات الجينية السيطرة على الإنبات وتحديدا المرجعيمكن تشريح بتوليد في السويداء والجنين. نحن هنا التفاصيل الإجراء لتجميع SCBA.

Introduction

في نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة، ويتكون غلاف البذرة من تيستا، وهي الطبقة الخارجية من النسيج الميت من أصل الأمهات، والسويداء، وطبقة وحيدة الخلية من الأنسجة الحية التي تحيط مباشرة الجنين ^1. وتستمد السويداء والجنين من الأحداث الإخصاب منفصلين: السويداء هو نسيج ثلاثي الصيغة الصبغية مع اثنين من الأم والأب واحد الجينوم في حين أن الجنين هو نسيج مضاعفا مع الأمهات واحدة واحدة الجينوم الأب ^2.

وتتمثل المهمة الرئيسية المسندة تقليديا إلى السويداء هو أن الأنسجة الغذائية. ومع ذلك، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن السويداء أيضا يلعب دورا مركزيا للسيطرة على إنبات البذور. أصبحت هذه الفكرة على ما يبدو لأول مرة في حالة السكون، وهي سمة التي أظهرتها البذور المنتجة حديثا. تفشل البذور لتنبت في سبات عميق رغم وجود ظروف إنبات مواتية. البذور تفقد السكون بهم بعد فترة النضوج وأصبحت nondormanر، أي أنها سوف تنبت عندما تتعرض لظروف إنبات مواتية. في كثير من الأنواع النباتية، بما في ذلك النباتات نبات الأرابيدوبسيس النموذج، يلزم معطف البذور على الاطلاق لمنع إنبات البذور نائمة منذ إزالة غلاف البذرة يؤدي النمو الجنيني وتخضير ^3،4. في نبات الأرابيدوبسيس، بثك وآخرون. احظت أن الإنبات ظلت مكبوتة بعد إزالة تيستا مع الحفاظ على السويداء المحيطة السويداء ^5. وأشارت هذه الملاحظات بشدة أن السويداء هو الأنسجة داخل غلاف البذرة تمارس النشاط القمعية على الجنين. ومع ذلك، وبذور التجارب إزالة معطف لا تساعد بالضرورة توضيح طبيعة النشاط القمعية التي تقدمها إنبات البذور معطف ولا تحديد الجينات التي تنفيذه.

قدمنا ​​مؤخرا فحص البذور الفراش معطف (SCBA) حيث يتم فصل المعاطف البذور والأجنة جسديا لكنها أبقت في الدنو وثيقميتي بحيث يتم الحفاظ على النشاط القمعية الإنبات التي تقدمها السويداء ^6. وSCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، nondormant، والبذور المعدلة وراثيا معطف والمواد الجنينية. ونتيجة لذلك، فإن مسارات الوراثية السيطرة على الإنبات وتعمل تحديدا في السويداء والجنين يمكن تشريح. تم استخدام SCBA في سياق السكون لإظهار أن السويداء تطلق حمض الأبسيسيك هرمون نباتي (ABA) نحو الجنين لقمع نموها ^6. وعلاوة على ذلك يمكن أن نستخدمها في SCBA لتحديد مسارات الإشارات التي تعمل في السويداء والأنسجة الجنينية لتعزيز السكون.

وتم تعزيز دور السويداء للسيطرة على إنبات المزيد من خلال النظر في حالة البذور nondormant تتعرض لنبض أحمر بكثير (FR) الخفيفة. في وقت مبكر عند تشرب البذور يعرف نبضة الضوء FR لمنع إنبات ^7،8. عندما أزيلت المعاطف البذور من بذور نبضة الضوء FRلم يستطع أن يمنع إنبات، يشير بقوة إلى أن السويداء ويمكن أيضا قمع إنبات البذور nondormant ^9. بشكل ملحوظ، ويمكن أيضا أن تستخدم SCBA أن ألخص التي تعتمد على تثبيط إنبات FR. يسمح هذا لإظهار أن ذلك يعتمد-FR تثبيط إنبات البذور هو أيضا عملية تنطوي على الإفراج ABA من السويداء ^9. وعلاوة على ذلك، سمحت SCBA تحديد مسارات مختلفة ضوء يشير الحكومية العاملة في السويداء والجنين للسيطرة على إنبات البذور nondormant استجابة لمنبهات ضوء ^9،10.

وبالتالي فإن SCBA يبدو أن تقنية موثوقة لاستكشاف وظيفة السويداء في سياق السيطرة على إنبات البذور. بل هو أيضا أداة قوية لتقييم ما إذا كانت الجينات في المختبر يشتبه في السيطرة على إنبات تعمل في السويداء، والجنين أو كليهما الأنسجة. نحن هنا بالتفصيل الخطوات المختلفة اللازمة لتجميع SCBA.

Protocol

مرة واحدة يتم تجميعها في SCBA، ويتم رصد نمو الأجنة على مدى عدة أيام. لذلك، قبل إجراء تشريح البذور والتجمع من SCBA، ويحتاج المرء لتعقيم البذور لتجنب التلوث المستقبلية التي يمكن أن تحول دون التقييم السليم لتأثير المواد معطف البذور على النمو الجنيني.

1. تعقيم البذور

1. صب 50-60 ميكرولتر من البذور نبات الأرابيدوبسيس ناضجة وجافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإعداد محلول الإيثانول 70٪.
2. إضافة 1 مل من الايثانول 70٪ الحل في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على البذور ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 1،200 دورة في الدقيقة في vortexer.
3. الطرد المركزي أنبوب microcentrifuge لمدة 3 ثانية في 4000 x ج لتركيز البذور في الجزء السفلي من الأنبوب.
4. نضح الحل الايثانول 70٪ باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
5. إضافة 1 مل من الماء المقطر المعقم لر وقال انه لا يزال أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على البذور.
6. هزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 1،200 دورة في الدقيقة.
7. الطرد المركزي أنبوب microcentrifuge لمدة 3 ثانية في 4000 x ج لتركيز البذور في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح طاف المياه باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من الأنبوب.
8. إضافة 1 مل من الماء المقطر الماء المعقم إلى أنبوب microcentrifuge لا تزال تحتوي على البذور. ضمان تدفق المياه تعلق متجانس البذور داخل الأنبوب. والهدف هنا هو لتجنب المزيد من الهز وذلك للحفاظ على سلامة البذور.
9. لندع البذور يستقر عن طريق الجاذبية في الجزء السفلي من الأنبوب من خلال ترك الأنبوب لا يزال لمدة 30 ثانية. نضح طاف المياه باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من الأنبوب.
10. كرر الخطوات من أربع مرات 1،8-1،9. عموما إجراء التعقيم يستغرق حوالي 30 دقيقة.

2. البذور تصفيح

ontent "> يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي للحفاظ على ظروف معقمة.

1. إعداد لوحة طبق بتري (100 مم، 20 مم الارتفاع) تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة بواسطة التعقيم محلول يحتوي على 4.3 غرام / لتر Murashige وسكوغ المتوسطة في 2.5 ملم 2 إعداد - (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES-KOH ؛ درجة الحموضة 5.7) و 0.8 غرام / لتر أجار. السماح للحل يبرد في حمام مائي 50 ° C قبل صب على لوحة طبق بتري.
2. إضافة 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى الأنبوب الذي يحتوي على البذور. resuspend والبذور ونقلها على سطح متوسطة الإنبات باستخدام ماصة القياسية مع تلميح 1 مل.
3. إزالة المياه المحيطة البذور على سطح متوسطة الإنبات باستخدام تلميح شفط فراغ.
4. مغادرة طبق بتري تحتوي البذور دون غطاء لها داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 2 ساعة لمزيد من التجفيف. إغلاق طبق بتري مع غطاء والسماح لها الوقوف تحت الصفحيتتدفق مجلس الوزراء لمدة 90 دقيقة بحيث مرت حوالي 4 ساعة منذ الشروع في إجراء التعقيم البذور (الخطوة 1.2).

3. تشريح البذور

الخطوات التالية تتطلب العمل مع stereomicroscope وضعت داخل مجلس الوزراء غطاء تدفق الصفحي. A دومون ملقط # 5 مع اقتطاع (أي حادة) نصائح يسهل كثيرا التعامل مع بذور (الشكل 1A).

1. إعداد طبق بيتري لوحة جديدة تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة. مكان على سطح المتوسطة اثنين جنبا إلى جنب العقيمة أوراق WHATMAN 3MM مستطيلة (1.5 سم × 1.0 سم؛ 1B الشكل، الخطوة 1). يتم تعقيمها WHATMAN 3MM رقة في الأوتوكلاف.
2. نقل البذور على أوراق WHATMAN 3MM باستخدام ملقط معقم (1B الشكل، الخطوة 2).
3. عقد البذور الفردية ضد الصحيفة WHATMAN 3MM عن طريق الضغط بلطف البذور باستخدام النصائح حادة جنبا إلى جنب من ملقط اقتطاع ( الشكل 1B، الخطوة 3).
4. قطع غلاف البذرة (تيستا والسويداء) من البذور باستخدام إبرة حقنة (مثل U100 الأنسولين حقنة + 1 مل حقنة، 0.33 ملم (29 G) × 12.7 مم) (الشكل 1B، الخطوة 4). شكل بذور نبات الأرابيدوبسيس هو بيضاوي وينصح لخفض معطف البذور على طول أطول محور شبه الرئيسي أقرب ما يمكن إلى المكان حيث انضم إلى النبتات الجذير (أي بعيدا عن الطرف المتطرف). وهذا يساعد على إطلاق سراح آمن للجنين في الخطوة التالية من إجراء تشريح.
5. دفع البذور ضد الصحيفة WHATMAN 3MM باستخدام النصائح حادة جنبا إلى جنب من ملقط اقتطاع (1B الشكل، الخطوة 5). هذه الخطوة يطلق الجنين من معطف البذور من خلال افتتاح بإنشائه في الخطوة 3.4 (1B الشكل، الخطوة 6). فمن المستحسن لتطبيق الضغط على البذور حيث غيض من النبتات هي في الأقرب إلى غيض من الجذير (أي بعيدا الابام افتتاح).

4. التجمع من معطف البذور الفراش الفحص (SCBA)

انظر المناقشة لاختيار المناسب من عدد من المعاطف البذور والأجنة.

1. إعداد طبق بيتري لوحة جديدة تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة. مكان على سطح المتوسطة قطعة مستطيلة معقم (3.5 سم × 5.0 سم) من شبكة نايلون (الشكل 2، الخطوة 1).
2. لتجنب الضرر والأجنة والمعاطف البذور يمكن نقلها إلى سطح حواف معدنية من ملقط من قبل دفعهم برفق باستخدام إبرة حقنة (الشكل 2، الخطوة 2). نقل الأجنة والمعاطف البذور على شبكة نايلون (الشكل 2، الخطوة 3).
3. تجميع طبقة دائرية واحدة من المعاطف البذور باستخدام ملقط اضعافها والإبرة التأكد من أن البذور المعاطف هي في القرب كما أقرب وقت ممكن (الشكل 2، الخطوة 4). محاولة لكشف أكبر قدر ممكن من افتتاح معطف البذور الناتجة عنإبرة صعودا. لم يختبر هذه الخطوة بشكل منهجي. ومع ذلك، فإنه يمكن أن تزيد من كفاءة SCBA منذ يتوقع أن ينتشر مباشرة من نحو الجنين بدلا من ذلك بعيدا عن المواد إنتشاري تثبيط نمو الجنين.
4. وضع الأجنة كما طبقة واحدة دائرية في وسط السرير معطف البذور تجميعها في الخطوة 4.3 (الشكل 2، الخطوة 5). ضمان أن الأجنة في القرب كما أقرب وقت ممكن.
5. احتضان SCBAs تحت ضوء مستمر (40 ميكرومول / م ² ق EC) في 20-21 درجة مئوية. في حالة حيث يتم استخدام نبضة FR لاعتقال إنبات، تجميع SCBA تحت الضوء الطبيعي، وتطبيق نبض FR كما هو موضح ⁹ وترك طبق بتري في الظلام.

النتائج

وأظهرت الأعمال السابقة أن بذور متحولة غير قادر على تجميع GA كانوا غير قادرين على الإنبات نتيجة لتراكم عالية ABA في البذور ^11،12. ومع ذلك، وعدم القدرة على الإنبات يتطلب معطف البذور منذ زواله يؤدي النمو الجنيني ^13. هذا وأشارت بقوة إلى أن السويداء من البذور غير قا?...

Discussion

البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) الإجراء الموضح هنا هو من حيث المبدأ ينطبق على أي ظرف من الظروف حيث يتم حظر إنبات البذور نبات الأرابيدوبسيس (أو تأخر) والتي يشتبه السويداء لتنفيذ هذا الاعتقال. هذا الأخير يمكن أن يتضح من إزالة غلاف البذرة (تيستا والسويداء) وملاحظا أن ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA