Семя пальто постельных принадлежностей Анализ чтобы Генетически Путешествуйте<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Как эндосперма управления прорастания семян в<em&gt; Арабидопсис</em

Резюме

Мы представляем процедуру, чтобы собрать семена пальто постельных принадлежностей анализа (АДА) от Arabidopsis семян THALIANA. АДА было показано, что мощным инструментом для изучения генетически и в пробирке, как контроль эндосперма всхожесть семян в покоящихся семян и в ответ на легких киев. АДА, в принципе, применимого в соответствии с любой ситуации, когда эндосперм подозревается влиять эмбрионального развития.

Аннотация

Arabidopsis эндосперм состоит из одного слоя клеток, окружающего из эмбриона и играть существенную роль для предотвращения прорастания покоящихся семян или, что из nondormant семян, облученных дальнего красного (FR) светового импульса. В целях дальнейшего разобраться в молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе прорастания репрессивный активность, оказываемое эндосперма, "семенной оболочки постельные принадлежности" анализ (АДА) был разработан. АДА представляет собой процедуру вскрытия физического разделения семенных оболочек и эмбрионов из семян, что позволяет контролировать рост эмбрионов на основной слой семенных оболочек. Примечательно, что АДА воссоздает прорастание репрессивные мероприятия кожуры в контексте покоя семян и FR-зависимого контроля всхожести семян. Поскольку АДА позволяет комбинаторной использование покоя, nondormant и генетически модифицированных семян пальто и эмбриональных материалов, генетических путей, контролирующих прорастание и специально опсплуатации в эндосперме и зародыше можно разрезать. Здесь мы подробно процедуру, чтобы собрать SCBA.

Введение

В зрелых семян Arabidopsis, семенной оболочки состоит из семенной кожуры, внешний слой мертвых тканей материнского происхождения, и эндосперма, один слой клеток живой ткани непосредственно окружающий зародыш ^1. Эндосперм и эмбрион являются производными от отдельных событий оплодотворения: эндосперм триплоидный ткани с двумя материнской и отцовской один генома, тогда как эмбрион является диплоидным ткани с одной материнской и одной отцовской генома ^2.

Основной функцией традиционно назначается эндосперма в том, что из питательной ткани. Тем не менее, она становится все более очевидным, что эндосперм также играет центральную роль для контроля прорастание семян. Это понятие стало первым очевидным в случае покоя, черта выставлены вновь произведенных семян. Покоящихся семян не в состоянии прорасти, несмотря на наличие благоприятных условий прорастания. Семена теряют покой после периода созревания и стать nondormanт, т.е. они прорастут при воздействии благоприятных условий прорастания. Во многих видов растений, в том числе модель завода Arabidopsis, семенной оболочки абсолютно необходимо для предотвращения прорастания покоящихся семян с удаления пальто семян вызывает эмбриональную рост и озеленение ^3,4. В Arabidopsis, Bethke соавт. Отметили, что всхожесть осталась репрессированных после удаления семенной кожуре при сохранении эндосперм, окружающий эндосперм ^5. Эти наблюдения сильно указали, что эндосперм ткань в семенной оболочки, оказывающей репрессивный деятельность на эмбрион. Однако эксперименты по удалению пальто семян не обязательно помочь выяснению природы прорастания репрессивной деятельности, предоставленную кожуры, ни определять гены, которые реализуют его.

Мы недавно представила семенной оболочки кроватей анализа (АДА), где семена пальто и эмбрионы физически разделены, но держал в тесном ProxiMity так что прорастание репрессивная деятельность обеспечивается эндосперма поддерживается ^6. АДА позволяет комбинаторной использование покоя, nondormant, и генетически модифицированных семян пальто и эмбриональных материалов. В результате, генетические контролирующие пути прорастание и конкретно работает в эндосперме и зародыше можно разрезать. АДА был использован в контексте покоя, чтобы показать, что эндосперм освобождает фитогормонов абсцизовой кислоты (ABA) в направлении эмбриона подавить его рост ^6. Кроме того, мы могли бы использовать SCBA определить сигнальные пути, работающих в эндосперме и эмбриональных тканей содействовать покоя.

Роль эндосперма контролировать всхожесть еще более укрепилась, рассматривая случай nondormant семян, подвергшихся воздействию импульса дальнего красного (FR) света. Раннее на набухания FR световой импульс, как известно, ингибируют прорастание ^7,8. Когда семена пальто были удалены из семян импульс FR светане смог препятствовать прорастанию, сильно предполагая, что эндосперм также может подавлять прорастание семян nondormant ^9. Примечательно, что АДА также могут быть использованы для резюмировать FR-зависимое ингибирование прорастания. Это позволило показать, что, что FR-зависимое ингибирование прорастания семян также процесс, включающий ABA освобождение от эндосперма ^9. Кроме того, АДА позволило выявить различные светло-сигнальных путей, работающих в эндосперме и зародыше, чтобы контролировать nondormant прорастание семян в ответ на легких киев ^9,10.

АДА поэтому быть надежным методом для изучения функции эндосперма в контексте контролем прорастания семян. Это также является мощным инструментом для оценки в пробирке ли гены подозреваемых контролировать всхожесть работать в эндосперме, эмбриона или обеих тканях. Здесь мы подробно различные шаги, необходимые для сборки SCBA.

протокол

После того, как собран АДА, рост зародышей контролируется в течение нескольких дней. Поэтому перед процедурой семян рассечение и монтаж SCBA, нужно стерилизовать семена, чтобы избежать будущих загрязнений, которые могут помешать надлежащую оценку влияния семян пальто материала на эмбрионального развития.

1. Семя Стерилизация

1. Налейте 50-60 мкл зрелых и сухих семян Arabidopsis в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и подготовить 70%-ный раствор этанола.
2. Добавить 1 мл 70% раствора этанола в микроцентрифужных трубки, содержащей семена и встряхивают при комнатной температуре в течение 10 мин при 1200 оборотах в минуту в Вортекс.
3. Центрифуга трубки микроцентрифужных в течение 3 сек при 4000 х г концентрировать семена в нижней части трубки.
4. Аспирируйте 70%-ный раствор этанола с использованием всасывающий наконечник вакуумного осторожно, оставляя семена в нижней части трубки микроцентрифужных.
5. Добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды до T он микроцентрифужных трубки еще содержащей семена.
6. Взболтать при комнатной температуре в течение 10 мин при 1200 оборотах в минуту.
7. Центрифуга трубки микроцентрифужных в течение 3 сек при 4000 х г концентрировать семена в нижней части трубки. Аспирируйте воды супернатант с помощью всасывающего наконечника вакуумного осторожно, оставляя семена в нижней части трубки.
8. Добавить 1 мл стерильной воды дистиллированной воде в микроцентрифужных трубки, содержащей все еще семена. Убедитесь, что поток воды однородно приостанавливает семена внутри трубки. Цель здесь состоит, чтобы избежать дальнейшего встряхивая, чтобы сохранить целостность семян.
9. Пусть семена осесть под действием силы тяжести в нижней части трубки, оставляя трубку еще в течение 30 сек. Аспирируйте воды супернатант с помощью всасывающего наконечника вакуумного осторожно, оставляя семена в нижней части трубки.
10. Повторите четыре раза шаги 1,8 - 1,9. Общая процедура стерилизации занимает около 30 мин.

2. Семя Покрытие

ontent "> Все последующие этапы выполняются в шкафу с ламинарным потоком для сохранения стерильных условиях.

1. Подготовка чашек Петри пластины (диаметр 100 мм, высота 20 мм), содержащих 30 мл среды для прорастания получены путем обработки в автоклаве раствор, содержащий 4,3 г / л Мурашига и Скуга в 2,5 мМ 2 - (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES-КОН , рН 5,7) и 0,8 г / л агара. Пусть решение остыть в водяной бане при 50 ° С перед заливкой его в посудомоечной чашку Петри.
2. Добавить 200 мкл стерильной дистиллированной воды в пробирку, содержащую семена. Ресуспендируют семена и передавать их на поверхности прорастания среде с использованием стандартного пипетку с наконечником в 1 мл.
3. Удалить воду, окружающую семена на поверхности прорастания среды с использованием наконечника вакуумного всасывания.
4. Оставьте чашку Петри, содержащую семена без крышкой внутри шкафу с ламинарным потоком в течение 2 часов для дальнейшей сушки. Закройте чашку Петри с крышкой и дать постоять под ламинарногошкаф течь в течение приблизительно 90 мин, так что около 4 часов прошло с момента начала процедуры семян стерилизации (шаг 1.2).

3. Семя Рассечение

Следующие шаги требуют работы с стереомикроскопом расположенной внутри ламинаре кабинета. Дюмон щипцы № 5 с усеченными (т.е. тупой) советов значительно облегчает обработку семян (рис. 1А).

1. Подготовьте новый Петри пластину, содержащую 30 мл среду для прорастания. Местонахождение на поверхности среды двух наложенных друг на друга прямоугольных стерильных работ Ватман 3 мм (1,5 см х 1,0 см; рис. 1б, шаг 1). Ватман 3 мм бумагу стерилизуют в автоклаве.
2. Трансфер семена на бумагах ватман 3мм с использованием стерильного пинцета (рис. 1В, шаг 2).
3. Держите индивидуальный семя к бумаге Ватман 3ММ, слегка нажав семя помощью расположенных рядом тупые кончики усеченных щипцов ( рис. 1В, шаг 3).
4. Обрежьте семенной оболочки (Testa и эндосперм) семени с помощью иглы шприца (например, U100 инсулин шприц + 1 мл шприц, 0,33 мм (29 г) х 12,7 мм) (Фигура 1В, этап 4). Форма Arabidopsis семян эллипсоидной и рекомендуется сократить семенной оболочки вдоль длинной полу-главной оси как можно ближе к месту, где семядоли соединены с корешка (т.е. от радикальной чаевые). Это помогает безопасного освобождения эмбриона в следующем шаге процедуры вскрытия.
5. Нажмите семя к бумаге Ватман 3ММ помощью расположенных рядом тупые кончики усеченных щипцов (рис. 1б, шаг 5). Этот шаг релизы эмбрион из кожуры через отверстие, созданной в шаге 3.4 (рис. 1В, шаг 6). Рекомендуется, чтобы применить толчок на семени где наконечник из семядоли в ближе к кончику корешка (т.е. далеко фром открытие).

4. Ассамблея кожуры Постельные принадлежности анализ (АДА)

См. обсуждение для правильного выбора числа семенных оболочек и эмбрионов.

1. Подготовьте новый Петри пластину, содержащую 30 мл среду для прорастания. Местонахождение на поверхности среды стерильными прямоугольный кусок (3,5 см х 5,0 см) из сетки нейлона (рис. 2, этап 1).
2. Во избежание повреждения, эмбрионы и семенных оболочек могут быть перемещены на поверхность металлических краев пинцетом, осторожно подталкивая их помощью иглы шприца (рис. 2, шаг 2). Эмбрионы передачи и семенных оболочек на нейлоновую сетку (рис. 2, шаг 3).
3. Соберите круглое и один слой семенных оболочек, используя притупилось щипцов и иглу убедившись, что семена пальто, как гораздо ближе близости, как это возможно (рис. 2, шаг 4). Попробуйте выставить как можно больше семенной оболочки открытие порожденнаяигла вверх. Этот шаг не был систематически проходят. Тем не менее, это может увеличить эффективность дыхательных аппаратов с к диффузии вещества, ингибирующие рост эмбриона, как ожидается, непосредственно диффундировать по направлению к эмбриона, а не от него.
4. Поместите эмбрионов в виде круглого один слой на центре пальто кровати семян собранных в шаге 4.3 (рис. 2, этап 5). Убедитесь, что эмбрионы, как гораздо ближе близости, как это возможно.
5. Инкубируйте SCBAs при непрерывном освещении (40 мкмоль / м ² с ЕС) в 20-21 ° С. В случае, когда импульс FR используется задержать прорастание, собрать SCBA при нормальном свете, применить FR импульса, как описано ⁹ и оставить чашку Петри в темноте.

Результаты

Предыдущие работы показали, что мутантные семена неспособны синтезировать GA были неспособны прорастать в результате накопления высокой ABA в семенах ^11,12. Тем не менее, неспособность прорастают требуется семенной оболочки с ее удаление вызывает эмбриональную ¹³ роста. Это че?...

Обсуждение

Процедура семенной оболочки постельные принадлежности анализ (АДА), описанный здесь, в принципе применимы к любому обстоятельствах, когда Arabidopsis всхожесть семян блокируется (или задержки) и где эндосперм подозревается реализовать этот арест. Последнее может быть подтверждено пут...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA