מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

Summary

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

Abstract

האנדוספרם ארבידופסיס מורכב משכבה תא בודדת המקיפה את העובר הבוגר ומשחקת תפקיד חיוני כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים או שזרעי nondormant מוקרנים על ידי אדום רחוק (FR) דופק את אור. על מנת לקבל תובנות לגבי המנגנונים גנטיים המולקולריים שבבסיס פעילות דיכוי הנביטה המופעל על ידי האנדוספרם נוסף, assay "מצעי מעיל זרע" (SCBA) תוכנן. SCBA הוא הליך נתיחת מפרידה פיזית בין מעילי זרע ועוברים מן הזרעים, המאפשר ניטור הצמיחה של עוברים בשכבה בסיסית של מעילי זרע. למרבה הפלא, SCBA reconstitutes פעילות דיכוי הנביטה של ​​מעיל הזרע בהקשר של תרדמת זרעים ובקרת FR תלויה של נביטת זרעים. מאז SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל רדום, nondormant וזרעים מהונדסים גנטי וחומרים עובריים, המסלולים הגנטיים שליטה נביטה ובמיוחד אופעל דוושה בהאנדוספרם והעובר יכולה להיות גזור. כאן אנו מפרט את ההליך כדי להרכיב SCBA.

Introduction

בזרעים בוגרים ארבידופסיס, מעיל הזרע מורכב מטסטה, שכבה חיצונית של רקמה מתה ממוצא אימהי, והאנדוספרם, שכבת תא בודדת של רקמה חי ישירות המקיפה את העובר ^1. האנדוספרם והעובר נגזרים מאירועים נפרדים הפריה: האנדוספרם הוא רקמת triploid עם שתי אימהיים ואבהי גנום אחד ואילו העובר הוא רקמה דיפלואידי עם אימהי אחד והגנום אבהי אחד ^2.

הפונקציה העיקרית שהוקצתה באופן מסורתי להאנדוספרם היא זה של רקמה תזונתית. עם זאת, זה הופך ברור יותר ויותר שהאנדוספרם גם ממלא תפקיד מרכזי לשלוט נביטת זרעים. רעיון זה הפך ראשון נראית לעין במקרה של תרדמת, תכונה הוצגה על ידי זרעי הפיק חדש. זרעים רדומים מצליחים לנבוט למרות נוכחותם של תנאי נביטה חיוביים. זרעים מאבדים תרדמתם אחרי תקופת הבשלה והפכו nondormant, כלומר הם ינבטו כאשר הם נחשפים לתנאי נביטה חיוביים. במיני צמחים רבים, כוללים צמח מודל ארבידופסיס, מעיל הזרע דרוש לחלוטין כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים מאז הסרת מעיל זרע מעוררת צמיחה עוברית והורקת ^3,4. בארבידופסיס, Bethke et al. ציין כי הנביטה נשארה מודחקת לאחר הסרת טסטה, תוך שמירה על האנדוספרם שמקיף את האנדוספרם ^5. תצפיות אלו מצביעות על כך שמאוד האנדוספרם הוא הרקמה בתוך מעיל זרע הפעלת פעילות דיכוי בעובר. עם זאת, ניסויי הסרת מעיל זרע לא בהכרח יעזרו להבהיר את אופי פעילות דיכוי הנביטה הניתן על ידי מעיל הזרע ולא בזיהוי גנים הליישם אותה.

לאחרונה הצגנו assay מצעי מעיל זרע (SCBA) שבו מעילי זרע ועוברים מופרדים פיזי אך המשיכו בקרבת proxiMity כך שפעילות דיכוי הנביטה הניתנת על ידי האנדוספרם נשמר ^6. SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל זרע רדום, nondormant, ומהונדס גנטי וחומרים עובריים. כתוצאה מכך, יכולים להיות גזורים המסלולים הגנטיים השליטה נביטה ובמיוחד פועלים בהאנדוספרם והעובר. SCBA שימש בהקשר של תרדמת כדי להראות שהאנדוספרם משחרר חומצת phytohormone abscisic (ABA) לעובר להדחיק הצמיחה שלה ^6. יתר על כן אנו יכולים להשתמש SCBA לזהות את מסלולי איתות הפועלים בהאנדוספרם ורקמות עובריים כדי לקדם תרדמת.

התפקיד של האנדוספרם לשלוט נביטה התחזק עוד יותר על ידי בהתחשב המקרה של זרעי nondormant נחשפו לדופק של אור אדום רחוק (FR). מוקדם על שקי זרע דופק FR אור ידוע לעכב נביטה ^7,8. כאשר מעילי זרע הוצאו מזרעי דופק של FR אורלא היה מסוגלת לעכב נביטה, חזק המצביע על כך האנדוספרם יכול גם לדכא את הנביטה של זרעי nondormant ^9. למרבה הפלא, SCBA יכול לשמש גם כדי לסכם עיכוב FR תלוי של נביטה. זה אפשר להראות כי כי עיכוב FR תלוי של נביטת זרעים הוא גם תהליך כרוך שחרור ABA מהאנדוספרם ^9. יתר על כן, SCBA אפשר זיהוי מסלולי אור איתות השונים הפועלים בהאנדוספרם והעובר לשלוט נביטת זרעי nondormant בתגובה לאותות אור ^9,10.

SCBA נראה אפוא להיות טכניקה אמינה לחקור את הפונקציה של האנדוספרם בהקשר של השליטה על נביטת זרעים. זהו גם כלי רב עוצמה על מנת להעריך במבחנה אם הגנים חשודים לשלוט נביטה לפעול בהאנדוספרם, העובר או שניהם הרקמות. כאן אנו פירוט הנדרש כדי להרכיב SCBA את השלבים השונים.

Protocol

ברגע שSCBA מורכב, הצמיחה של עוברים מנוטרת על פני כמה ימים. לכן, לפני הליך הזרע לנתיחה וההרכבה של SCBA, צריך לעקר זרעים כדי למנוע זיהומים בעתיד שיכול למנוע הערכה נכונה של ההשפעה של חומר מעיל זרע על צמיחה עוברית.

1. עיקור זרע

1. יוצקים 50-60 μl של זרעי ארבידופסיס בוגרים ויבשים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ולהכין פתרון אתנול 70%.
2. הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול פתרון לצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים ולנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל"ד בvortexer.
3. צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור.
4. לשאוב את פתרון אתנול 70% באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של צינור microcentrifuge.
5. הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי לא הוא צינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים.
6. לנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל"ד.
7. צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור.
8. הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים מים סטריליים לצינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. ודא כי זרימת המים homogenously משהה את הזרעים בתוך הצינור. המטרה כאן היא למנוע טלטול נוסף, כדי לשמור על שלמות הגרעינים.
9. בואו הזרעים להתיישב על ידי כוח הכבידה בחלק התחתון של הצינור על ידי השארת הצינור עדיין ל30 שניות. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור.
10. חזור על פעולה ארבע פעמים על שלבים 1.8-1.9. בסך הכל הליך העיקור לוקח בערך 30 דקות.

2. זרעי ציפוי

ontent "> כל הצעדים הבאים מבוצעים בתוך זרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים.

1. הכן צלחת צלחת פטרי (קוטר 100 מ"מ, 20 גובה מ"מ) המכיל 30 מיליליטר של מדיום נביטה שהוכן על ידי מעוקר תמיסה המכילה 4.3 g / L Murashige ובינוני Skoog ב2.5 מ"מ 2 - (N-morpholino) חומצת ethanesulfonic (MES-KOH ; PH 5.7) ואגר 0.8 גר '/ ליטר. תן הפתרון להתקרר באמבט מים 50 מעלות צלזיוס לפני ששופך אותה על צלחת צלחת פטרי.
2. הוסף 200 μl של מים מזוקקים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים. Resuspend את הזרעים ולהעביר אותם על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות פיפטה סטנדרטית עם טיפ 1 מיליליטר.
3. הסר את המים המקיפים את הזרעים על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות קצה יניקת ואקום.
4. השאר את צלחת פטרי המכילה את הזרעים בלי המכסה שלו בתוך הזרימה למינרית לשעה 2 לייבוש נוסף. סגור את צלחת פטרי עם המכסה ולתת לזה לעמוד מתחת למינריתזרימת ממשלה כ -90 דקות, כך שבערך 4 שעות חלפו מאז תחילתו של הליך עיקור זרעים (שלב 1.2).

3. Dissection הזרע

השלבים הבאים מחייבים עבודה עם סטראו הונח בתוך ארון הזרימה למינרית. מלקחיים דומון # 5 עם טיפים קטומים (כלומר קהה) מקל באופן משמעותי את הטיפול בזרעים (איור 1 א).

1. הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של שני מסמכים זה לצד זה מלבני הבינוני סטרילי Whatman 3MM (1.5 סנטימטר x 1.0 סנטימטר; איור 1, שלב 1). טמן 3MM נייר מעוקר ב החיטוי.
2. העבר את הזרעים על ניירות Whatman 3MM באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 1, שלב 2).
3. תחזיק זרע בודד נגד עיתון Whatman 3MM ידי הלחיצה בעדינות את הזרע באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים ( איור 1, שלב 3).
4. חותכים את קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) של הזרע באמצעות מחט מזרק (מזרק מיליליטר למשל U100 אינסולין מזרק + 1, 0.33 מ"מ (29 G) x 12.7 מ"מ) (איור 1 ב, שלב 4). הצורה של זרעי ארבידופסיס היא ellipsoidal ומומלצת לחתוך את מעיל הזרע לאורך הציר למחצה העיקרי הארוך ביותר הקרוב ככל האפשר למקום שבו הפסיגים מצטרפים לradicle (כלומר הרחק בקצה הקיצוני). זה עוזר לשחרורו הבטוח של העובר בשלב הבא של הליך הנתיחה.
5. לדחוף את הזרע נגד עיתון Whatman 3MM באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (איור 1, שלב 5). צעד זה משחרר את העובר מתוך מעיל הזרע דרך הפתח שנוצר בשלב 3.4 (איור 1 ב, שלב 6). מומלץ ליישם את הדחיפה בזרע שבו קצה הפסיגים נמצא בקרוב ביותר לקצה radicle (כלומר משם frאום הפתיחה).

4. הרכבה של מעיל זרע מצעים Assay (SCBA)

ראה דיון לבחירה הנכונה של מספר שכבות זרע והעוברים.

1. הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של מדיום חתיכת סטרילי מלבנית (3.5 סנטימטר x 5.0 סנטימטר) של רשת ניילון (איור 2, שלב 1).
2. כדי למנוע נזק, ניתן להעביר עוברים ומעילי זרע אל פני השטח של הקצוות המתכתיים של המלקחיים על ידי בעדינות דוחף אותם באמצעות מחט המזרק (איור 2, שלב 2). העברת עוברים ומעילי זרע על רשת ניילון (איור 2, שלב 3).
3. להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע באמצעות המלקחיים הקהות ואת המחט ולוודא כי מעילי זרעים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר (איור 2, שלב 4). נסה לחשוף עד כמה שניתן את פתיחת מעיל הזרע שנוצרה על ידימחט כלפי מעלה. צעד זה לא נבדק באופן שיטתי. עם זאת, זה יכול להגביר את היעילות של SCBA מאז חומרי diffusible עיכוב הצמיחה של העובר צפויים לנטרל ישירות לכיוון את העובר ולא ממנו.
4. מניחים את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע שנאספה בשלב 4.3 (איור 2, שלב 5). להבטיח כי העוברים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר.
5. דגירה SCBAs תחת אור הרציף (40 μmol / m ² של EC) בשעה 20-21 ° C. במקרה שבו דופק FR משמש לעצור את הנביטה, להרכיב SCBA תחת אור רגיל, להחיל את דופק FR כמתואר ⁹ ולהשאיר צלחת פטרי בחושך.

תוצאות

העבודות קודמות הראו כי זרעים שעברו מוטציה מסוגל לסנתז GA לא היו מסוגלים לנבוט כתוצאה מהצטברות הגבוהה ABA בזרעי ^11,12. עם זאת, חוסר היכולת לנבוט דורשת מעיל הזרע מאז הסרתו מעוררת ¹³ צמיחה עוברית. זה מאוד הצביע על כך שהאנדוספרם של זרעים מסוגלים לסנתז GA מפרסם ABA לחסו...

Discussion

הליך assay מצעי מעיל הזרע (SCBA) שתואר כאן הוא בעיקרון חל על כל נסיבות שבי נביטת זרעי ארבידופסיס חסומה (או עיכוב) ושבו האנדוספרם חשד לביצוע המעצר הזה. יכול להיות שמעיד האחרון על ידי הסרת קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) והתבוננות שתמורת צמיחה עוברית מהר יותר ביחס לזה שנצפתה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA