种皮床品检测到基因探索<em&gt;体外</em&gt;如何控制胚乳种子萌发的<em&gt;拟南芥</em

摘要

我们目前的程序，从拟南芥种子组装种皮床上用品法（SCBA）。空气呼吸器被证明是一个强大的工具，基因和体外探索胚乳控制种子发芽的种子的休眠和反应轻线索如何。空气呼吸器是适用的原则，在胚乳被怀疑影响胚胎生长任何情况下。

摘要

拟南芥胚乳由周边的成熟胚和播放，以防止休眠种子的萌发，或由远红光（FR）的光脉冲照射nondormant种子的重要作用单细胞层。为了进一步洞察底层由胚乳施加的发芽压制性活性的分子遗传机制，一个“种皮寝具”测定法（SCBA）被设计。空气呼吸器是一种剥离的过程实际上从种子，因此可以监视胚胎的生长种皮的下层上分离种皮和胚。值得注意的是，空气呼吸器重新组成种皮发芽镇压活动在种子休眠和萌发的FR-依赖的控制的情况下。由于空气呼吸器允许组合使用休眠，nondormant和转基因种皮和胚材料的遗传途径控制的萌发和专门运erating在胚乳和胚可以被解剖。下面我们详细的程序来组装一个自给式呼吸器。

引言

在拟南芥成熟种子的种皮是由种皮，母体来源的死组织的外层，和胚乳，直接围绕胚胎¹活组织的单细胞层。胚乳和胚胎均来自不同的施肥事件：胚乳是三倍体组织有两个产妇和一个父亲的基因组，而胚胎是一个产妇和一个父亲的基因组²二倍体组织。

传统上分配给该胚乳的主要功能是，营养组织。然而，它正变得越来越明显的是，胚乳也起着控制种子发芽的核心作用。这个概念在休眠的情况下成为了第一个明显的，由新产生的种子表现出的特质。休眠种子不能发芽，尽管有利发芽条件的存在。种子成熟期后失去他们的休眠，成为nondormanT， 即它们会发芽，当暴露在有利的条件下催芽。在许多植物物种，其中包括模式植物拟南芥 ，种皮是绝对必要的，以防止休眠种子的萌发，因为种皮去除触发胚胎生长和绿化^3,4。在拟南芥中 ，贝思克等人观察到，除去种皮，同时保持周围的胚乳⁵胚乳萌发后仍然压抑。这些观察结果强烈表明，胚乳，种皮施加的镇压活动在胚胎内的组织。然而，种皮去除的实验并不一定有助于澄清发芽镇压活动由种皮所提供的性质，也不确定实现它的基因。

我们最近推出了种皮床上用品法（SCBA），其中种皮和胚在物理上分开，但保持着密切PROXIMITY使得由胚乳提供的发芽压制性的活性得以维持^6。空气呼吸器允许组合使用休眠，nondormant，和转基因种皮和胚料。其结果是，在遗传途径控制发芽并在胚乳和胚具体操作可以被解剖。空气呼吸器被用于休眠的 ​​情况下，显示的胚乳释放激素脱落酸（ABA）对胚胎来抑制其生长^6。此外，我们还可以使用空气呼吸器，以确定在胚乳操作的信号通路和胚胎组织，以促进休眠。

胚乳控制发芽的作用考虑承受远红（FR）的光脉冲nondormant种子的情况下得到进一步加强。在种子吸胀初期帧中继光脉冲是已知的抑制发芽^7,8。当从种子中除去种皮FR光脉冲无法抑制发芽，强烈的建议，胚乳也可以抑制nondormant ⁹种子的萌发。值得注意的是，SCBA也可以用来概括发芽的FR-依赖性抑制。这可以表明，种子萌发的FR-依赖性抑制也有来自胚乳⁹阿坝释放的过程。此外，SCBA允许识别在胚乳和胚来控制nondormant种子萌发响应于光线索^9,10操作不同的光信号转导途径。

因此，空气呼吸器似乎是一个可靠的技术来探索种子萌发的控制范围内胚乳的功能。这也是一个强大的工具， 在体外 ，以评估是否涉嫌基因控制发芽的胚乳，胚或两者的组织工作。下面我们详细组装一台空气呼吸器所需的各个步骤。

研究方案

一旦空气呼吸器被组装时，胚胎的生长被监控超过数天。因此，空气呼吸器的种子解剖过程和组装之前，需要消毒的种子，以避免将来的污染，可以防止种皮材料对胚胎生长的影响，正确的评估。

1。种子消毒

1. 倒入50-60微升成熟和拟南芥干种子在1.5 ml离心管中，并准备一个70％的乙醇溶液。
2. 加入1毫升70％的乙醇溶液至含有种子的微量离心管中，并在1,200 rpm下在涡流混合器摇动在室温下搅拌10分钟。
3. 离心机的离心管中，持续3秒在4000×g离心浓缩种子在管的底部。
4. 用真空吸嘴小心而使种子在微量离心管的底部吸出70％的乙醇溶液。
5. 加入1毫升无菌蒸馏水至吨他离心管中仍含有的种子。
6. 摇在室温下在1200rpm 10分钟。
7. 离心机的离心管中，持续3秒在4000×g离心浓缩种子在管的底部。用真空吸嘴小心而使种子在管的底部抽吸水上清液。
8. 加入1毫升无菌水蒸馏水至仍含有种子的微量离心管中。确保水的流动均匀挂起管内的种子。这样做的目的是为了避免进一步的晃动，从而保持种子的完整性。
9. 让种子定下来通过重力在该管的底部由仍留在管30秒。用真空吸嘴小心而使种子在管的底部抽吸水上清液。
10. 重复四次步骤1.8 - 1.9。整体灭菌过程大约需要30分钟。

2。种子电镀

ontent“>所有后续步骤都在层流柜中进行，以保持无菌条件。

1. 准备陪替氏培养皿盘（100毫米直径20毫米高）制备通过高压灭菌含有4.3克/ L的Murashige和Skoog培养基中2.5毫米2的溶液中装有30ml萌发培养基 - （N-吗啉）乙磺酸（MES-KOH ; pH值5.7）和0.8克/升琼脂。设在50℃水浴中冷却液倒在培养皿板浇筑前。
2. 加入200μl的无菌蒸馏水到含种子的试管中。重悬的种子，并用标准移液管与1毫升尖萌发培养基的表面上传送。
3. 除去周围用真空吸嘴的萌发培养基的表面上的种子的水分。
4. 离开含种子没有它的盖培养皿中的层流柜内2小时为进一步干燥。关闭培养皿的盖子，让它经得起层下流柜约90分钟，使约4小时，自该种子灭菌过程（步骤1.2）的启动通过。

3。种子解剖

下面的步骤必要用立体显微镜放置在层流罩柜内工作。一个杜蒙钳＃5于截断（ 即钝）提示极大地方便了种子的处理（ 图1A）。

1. 准备装有30ml萌发培养基的新培养皿板。这里的介质2并列的矩形灭菌的Whatman 3MM纸（1.5厘米×1.0厘米; 图1B，步骤1）的表面上。的Whatman 3MM纸被高压灭菌。
2. 传送上使用无菌镊子（ 图1B，步骤2）中的Whatman 3MM纸种子。
3. 通过使用截断钳的并列钝头（轻轻按压种子仇视的Whatman 3MM纸单粒种子图1B，步骤3）。
4. 切割用注射器针头种子的种皮（外种皮和胚乳）（ 如 U100胰岛素注射器+ 1ml注射器，0.33毫米（29 G）×12.7毫米）（ 图1B，步骤4）。 拟南芥种子的形状是椭圆形的，因此建议削减种皮沿尽可能接近的地方子叶接合到胚根（ 即远离基端部）的位置上最长的半主轴。这有助于在清扫过程的下一步骤中胚胎的安全释放。
5. 使用截短的镊子（ 图1B，步骤5）的并置的钝头推压的Whatman 3MM纸上的种子。此步骤会释放出胚种皮通过在步骤3.4（ 图1B，步骤6）中创建的开口。它建议申请在该处的子叶的顶端是在最靠近胚根的尖端处的种子（ 即相差fr处的推OM开放）。

4。大会的种皮床品含量（SCBA）

为种皮和胚胎的数量的适当的选择看讨论。

1. 准备装有30ml萌发培养基的新培养皿板。地方的介质的表面上的无菌一块长方形的尼龙网片（3.5厘米×5.0厘米）（ 图2，步骤1）。
2. 为避免损坏，胚胎和种皮可以通过使用注射器针头（ 图2，步骤2）轻轻推他们移动到钳子的金属边缘的表面上。转移的胚胎和种皮上的尼龙筛网（ 图2，步骤3）。
3. 组装种皮的使用钝钳和针确保种子外套是在尽可能多的靠近，尽可能地（ 图2，步骤4）的圆形和单层。尝试以暴露尽可能由所产生的种皮开口针向上。这一步是没有系统地测试。但是，它可能会增加空气呼吸器的效率，因为可扩散物质抑制了胚胎的生长预期直接扩散出来对胚胎而不是远离它。
4. 将胚胎作为组装在步骤4.3种皮床中心的环状单层（ 图2，步骤5）。确保胚胎是在尽可能多的更接近越好。
5. 在20-21℃下孵育下连续光照（40微摩尔/米^2秒 EC）的SCBAs在帧中继脉冲用来逮捕发芽，组装空气呼吸器正常光线下，与实际情况相符的FR脉冲^9，离开培养皿在黑暗的情况下。

结果

以前的工作表明，突变体种子无法合成GA无法发芽，作为高ABA积累在种子^11,12的结果。但是，不能发芽，需要种皮，因为它的去除触发胚胎生长^13。这有力地表明，种子不能合成赤霉素的胚乳被释放ABA阻止胚胎发育。因此，我们预计种子大衣不能合成GA阻止胚胎在呼吸器的增长不像种皮不能合成赤霉素和脱落酸。这里我们使用GA1-21（Salk的插入线Salk_109115）携带一个T-DNA插入破?...

讨论

这里所描述的种皮床上用品法（SCBA）程序原则上适用于其中拟南芥种子发芽受阻（或延迟），并在那里胚乳被怀疑实施这一逮捕任何情况下。后者可通过除去种皮（外种皮和胚乳），并观察到胚胎生长前进速度相对于所观察到的，当胚胎是由种皮包围得以证实。发芽可能被阻止响应于特定环境的物理参数（ 例如 ，水或潜在的光质）或在特定的遗传背景（ 例如，不存在GA合成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA