Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Come la Germinazione Controlli endosperma del seme in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Riepilogo

Vi presentiamo la procedura per assemblare un seme saggio di biancheria da letto di mano (SCBA) da Arabidopsis thaliana semi. La SCBA ha dimostrato di essere uno strumento potente per esplorare geneticamente e in vitro come il germinazione del seme controlli endosperma nei semi dormienti e in risposta a stimoli luminosi. L'autorespiratore in linea di principio applicabile in qualsiasi situazione in cui l'endosperma è sospettato di influenzare la crescita embrionale.

Abstract

L'endosperma Arabidopsis è costituito da un singolo strato di cellule che circonda l'embrione maturo e gioca un ruolo essenziale per impedire la germinazione dei semi dormienti o di semi nondormant irradiati da un impulso di luce rosso lontano (FR). Al fine di ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi genetici molecolari alla base della germinazione attività repressiva esercitata dal endosperma, un saggio di "assestamento cappotto di seme" (SCBA) è stato concepito. La SCBA è una procedura di dissezione separando fisicamente tegumenti ed embrioni da semi, che consente il monitoraggio della crescita di embrioni in uno strato sottostante di cappotti di seme. Sorprendentemente, l'autorespiratore ricostituisce la germinazione attività repressive del cappotto di seme nel contesto della dormienza dei semi e di controllo FR-dipendente di germinazione dei semi. Poiché l'autorespiratore consente l'utilizzo combinatoria di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificatamente opdendo per l'endosperma ed embrione può essere sezionato. Qui ci dettaglio la procedura per assemblare un autorespiratore.

Introduzione

In Arabidopsis semi maturi, il cappotto di seme è composto dalla testa, uno strato esterno di tessuto morto di origine materna, e l'endosperma, un singolo strato di cellule di tessuto vivo che circonda direttamente l'embrione ^1. L'endosperma e l'embrione sono derivati ​​da eventi fecondazione distinti: il endosperma è un tessuto triploide con due materna e un genoma paterno che l'embrione è un tessuto diploide con una materna e un genoma paterno ^2.

La funzione principale tradizionalmente assegnato al endosperma è quello di un tessuto nutritivo. Tuttavia, è sempre più evidente che l'endosperma svolge un ruolo centrale per controllare la germinazione dei semi. Questa nozione è diventato il primo evidente nel caso di dormienza, un tratto esibita da semi di nuova produzione. Semi dormienti non riescono a germinare nonostante la presenza di condizioni di germinazione favorevoli. I semi perdono la loro dormienza dopo un periodo di maturazione e diventano nondormant, cioè germineranno quando esposto a condizioni favorevoli di germinazione. In molte specie vegetali, tra cui la pianta modello Arabidopsis, il cappotto di seme è assolutamente necessaria per impedire la germinazione dei semi dormienti poiché la rimozione tegumento innesca la crescita embrionale e greening ^3,4. In Arabidopsis, Bethke et al. Ha osservato che la germinazione è rimasta repressa dopo aver tolto la testa, pur mantenendo l'endosperma che circonda l'endosperma ^5. Queste osservazioni hanno indicato con forza che l'endosperma è il tessuto all'interno del cappotto di seme esercitando un'attività repressiva sull'embrione. Tuttavia, seme esperimenti rimozione coat non necessariamente aiutano chiarire la natura della germinazione attività repressiva fornite dal tegumento né identificare i geni che implementano.

Abbiamo recentemente introdotto un test di biancheria cappotto di seme (SCBA) dove cappotti di seme ed embrioni sono separati fisicamente, ma tenuti in prossimmità modo che l'attività repressiva germinazione fornita dal endosperma viene mantenuta ^6. L'autorespiratore consente l'uso combinatorio di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali. Come risultato, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificamente operante nel endosperma ed embrione può essere sezionato. La SCBA stato usato nel contesto della dormienza per dimostrare che l'endosperma rilascia l'acido abscissico phytohormone (ABA) verso l'embrione di reprimere la sua crescita ^6. Inoltre, potremmo usare l'autorespiratore per identificare le vie di segnalazione che operano in endosperma e tessuti embrionali per promuovere la dormienza.

Il ruolo del endosperma di controllare la germinazione è stata ulteriormente rafforzata considerando il caso delle sementi nondormant esposti a un impulso di rosso lontano (FR) della luce. Presto su imbibizione semi di un impulso luminoso FR è noto per inibire la germinazione ^7,8. Quando tegumenti sono stati rimossi dai semi un impulso di luce FRera in grado di inibire la germinazione, suggerendo fortemente che l'endosperma può anche reprimere la germinazione dei semi nondormant ^9. Sorprendentemente, la SCBA potrebbe anche essere utilizzato per ricapitolare inibizione FR-dipendente di germinazione. Questo ha permesso di dimostrare che tale FR-dipendente inibizione della germinazione dei semi è anche un processo che coinvolge ABA liberazione dal endosperma ^9. Inoltre, l'autorespiratore permesso identificare le differenti vie di segnalazione luminosa che operano nel endosperma e l'embrione di controllare la germinazione dei semi nondormant in risposta a stimoli luminosi ^9,10.

La SCBA sembra quindi essere una tecnica affidabile per esplorare la funzione del endosperma nell'ambito del controllo di germinazione dei semi. E 'anche un potente strumento per valutare in vitro se i geni sospettati di controllare germinazione operare nel endosperma, l'embrione o entrambi i tessuti. Qui abbiamo dettaglio le varie fasi necessarie per assemblare un autorespiratore.

Protocollo

Una volta che il SCBA è assemblato, la crescita di embrioni viene monitorato per diversi giorni. Pertanto, prima della procedura di dissezione seme e montaggio del autorespiratori, si ha la necessità di sterilizzare i semi per evitare contaminazioni future che potrebbero impedire la corretta valutazione dell'effetto di materiale tegumento sulla crescita embrionale.

1. Seed Sterilizzazione

1. Versare 50-60 ml di semi di Arabidopsis maturi e secchi in una provetta da 1,5 ml e preparare una soluzione di etanolo al 70%.
2. Aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% per la provetta contenente i semi e agitare a temperatura ambiente per 10 min a 1200 rpm in un vortex.
3. Centrifugare provetta per 3 sec a 4.000 xg per concentrare sementi al fondo della provetta.
4. Aspirare la soluzione di etanolo al 70% con una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
5. Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile per t egli provetta contenente ancora i semi.
6. Agitare a temperatura ambiente per 10 min a 1200 rpm.
7. Centrifugare provetta per 3 sec a 4.000 xg per concentrare sementi al fondo della provetta. Aspirare il surnatante acqua utilizzando una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
8. Aggiungere 1 ml di acqua distillata acqua sterile alla provetta contenente ancora i semi. Assicurarsi che il flusso di acqua sospende omogeneamente i semi all'interno del tubo. L'obiettivo è quello di evitare un ulteriore agitazione in modo da preservare l'integrità dei semi.
9. Lasciare che i semi depositano per gravità sul fondo del tubo lasciando il tubo ancora per 30 sec. Aspirare il surnatante acqua utilizzando una punta di aspirazione vuoto, lasciando accuratamente i semi sul fondo della provetta.
10. Ripetere quattro volte i passaggi 1,8-1,9. Nel complesso la procedura di sterilizzazione dura circa 30 min.

2. Seed placcatura

ONTENUTO "> Tutte le fasi successive vengono eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni di sterilità.

1. Preparare una piastra piastra di Petri (diametro 100 mm, altezza 20 mm) contenente 30 ml di mezzo di germinazione preparato autoclavando una soluzione contenente 4,3 g / L Murashige e Skoog in 2,5 mM 2 - (N-morfolino) acido etansolfonico (MES-KOH ; pH 5.7) e 0,8 g / L di agar. Lasciare raffreddare la soluzione in un bagno d'acqua a 50 ° C prima di versarlo sulla piastra piastra Petri.
2. Aggiungere 200 ml di acqua distillata sterile per il tubo contenente i semi. Risospendere i semi e trasferirli sulla superficie del mezzo di germinazione con una pipetta standard con una punta di 1 ml.
3. Rimuovere l'acqua che circonda i semi sulla superficie del mezzo di germinazione con una punta di aspirazione sotto vuoto.
4. Lasciare la piastra Petri contenente i semi senza coperchio all'interno della cappa a flusso laminare per 2 ore per ulteriore essiccamento. Chiudere la capsula di Petri con il coperchio e lasciar riposare sotto il laminareflusso armadio per circa 90 minuti in modo che circa 4 ore sono passati da quando l'avvio della procedura di sterilizzazione seme (fase 1.2).

3. Seed Dissection

Le seguenti operazioni richiedono lavoro con uno stereomicroscopio posto all'interno dell'armadio cappa a flusso laminare. Un Dumont pinze # 5 con troncate consigli (cioè smussato) facilita notevolmente la manipolazione dei semi (Figura 1A).

1. Preparare una nuova piastra capsula di Petri contenente 30 ml di terreno di germinazione. Posto sulla superficie delle medie due rettangolari sterili carte Whatman 3MM giustapposte (1,5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, step 1). Whatman 3MM carta viene sterilizzato in autoclave.
2. Trasferire i semi delle carte Whatman 3MM utilizzando pinze sterili (Figura 1B, step 2).
3. Tenere un seme di persona contro la carta Whatman 3MM premendo delicatamente il seme con le punte smussate giustapposti della pinza troncati ( Figura 1B, punto 3).
4. Tagliare il cappotto di seme (testa e endosperma) del seme utilizzando un ago della siringa (ad esempio U100 insulina siringa + 1 siringa ml, 0,33 millimetri (29 G) x 12,7 mm) (Figura 1B, punto 4). La forma del seme di Arabidopsis è ellissoidale e si consiglia di tagliare il cappotto di seme lungo la più lunga semi-asse principale più vicino possibile al luogo in cui i cotiledoni sono uniti alla radichetta (cioè lontano dalla punta radicale). Questo aiuta il rilascio sicuro dell'embrione nella fase successiva del procedimento dissezione.
5. Spingere il seme contro la carta Whatman 3MM utilizzando le punte smussate giustapposti della pinza troncate (Figura 1B, punto 5). Questo passaggio rilascia l'embrione fuori il cappotto di seme attraverso l'apertura creata nel passaggio 3.4 (Figura 1B, punto 6). Si raccomanda di applicare la spinta sul seme in cui la punta dei cotiledoni sono in più vicino alla estremità radicolare (cioè lontano from l'apertura).

4. Assemblea del cappotto di seme Bedding Assay (SCBA)

Si veda la discussione per la corretta scelta del numero di cappotti di seme ed embrioni.

1. Preparare una nuova piastra capsula di Petri contenente 30 ml di terreno di germinazione. Posto sulla superficie del terreno un pezzo rettangolare sterile (3.5 cm x 5,0 centimetri) di maglia di nylon (Figura 2, punto 1).
2. Per evitare danni, embrioni e tegumenti possono essere spostati alla superficie dei bordi metallici della pinza spingendo delicatamente utilizzando l'ago della siringa (Figura 2, punto 2). Embrioni di trasferimento e tegumenti sulla maglia di nylon (Figura 2, punto 3).
3. Montare uno strato circolare e singola di tegumenti utilizzando le pinze smussate e l'ago fare in modo che i semi cappotti sono in quanto una maggiore vicinanza possibile (Figura 2, punto 4). Prova di esporre il più possibile l'apertura tegumento generato dall'ago verso l'alto. Questo passo non è stato sistematicamente testato. Tuttavia, potrebbe aumentare l'efficienza del SCBA da sostanze diffusibili inibiscono la crescita dell'embrione dovrebbero diffondere direttamente verso l'embrione piuttosto che lontano da esso.
4. Mettere gli embrioni come un unico strato circolare al centro del letto tegumento assemblato in fase 4.3 (Figura 2, punto 5). Assicurarsi che gli embrioni sono tanto maggiore vicinanza possibile.
5. Incubare le autorespiratori sotto luce continua (40 micromol / m ² s ec) a 20-21 ° C. Nel caso in cui un impulso FR viene utilizzato per arrestare la germinazione, montare il SCBA a luce normale, applica l'impulso FR come descritto ⁹ e lasciare piastra di Petri nell'oscurità.

Risultati

Lavoro precedente ha mostrato che i semi mutanti incapaci di sintetizzare GA erano in grado di germinare come risultato di accumulo alta ABA in semi ^11,12. Tuttavia, l'incapacità di germinare richiede il cappotto di seme fin dalla sua rimozione innesca embrionale ¹³ la crescita. Questo indica fortemente che l'endosperma dei semi in grado di sintetizzare GA sta rilasciando ABA per bloccare la crescita embrionale. Ci aspettiamo quindi semi cappotti in grado di sintetizzare GA per bloccare la...

Discussione

Procedura Il test biancheria cappotto di seme (SCBA) qui descritto è in linea di principio applicabile a qualsiasi circostanza in cui la germinazione del seme di Arabidopsis è bloccato (o ritardato) e dove l'endosperma è sospettato di implementare questo arresto. Quest'ultimo può essere provata togliendo il cappotto di seme (testa e endosperma) e osservando che i proventi di crescita embrionali più veloce rispetto a quella osservata quando gli embrioni sono circondati dal tegumento. La germinazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA