طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

Summary

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Abstract

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.

Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.

Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

Introduction

وظلت وظيفة بالضبط من exosomes تعميم مجهولة لفترة طويلة من الزمن. حتى الآن ليست مفهومة تماما آلية المسار الكامل من exosomes. منذ exosomes تحمل بصورة رئيسية أعطيت المستضدات والبروتينات والحمض النووي الريبي (مرنا وميرنا) التي تتعلق بهم إلى خلية الوالدين الأصلية، وظيفتها والإرسال يشير خلية خلية ذات الأولوية.

وقد وصفت العديد من الأساليب المختلفة في الأدب لعزل والكشف الكمي للexosomes ^1،2. ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن "معيار ذهبي". وفي الوقت نفسه فإن غالبية العلماء نشط في مجال البحوث exosome يتفقون على أن طريقة متسقة من العزلة وتبرر للغاية لتحقيق درجة أعلى من المقارنة بين التقارير والدراسات المختلفة.

مضان تنشيط الفرز الخلية (FACS) هو الأداة الأكثر شيوعا وانتشارا للتحليل exosome ^3. FACS لديه بنefit ذلك، عن طريق وضع العلامات مضان، الخلايا من أصول مختلفة يمكن مقارنة في خطوة واحدة. المساوئ الرئيسية للFACS هي أن هذه الطريقة ليست حساسة بما فيه الكفاية لتحديد جزيئات أصغر من 0.5 ميكرومتر ^4، في حين exosomes عموما بين 30-120 نانومتر في القطر ^5، وحتى أقل لقياس حجمها.

المجهر الإلكتروني (SEM) وانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هي أدوات أخرى لتحليل حجم الجسيمات ومورفولوجية exosomes. ومع ذلك، على حد سواء SEM وTEM يكون العيب أن إعداد عينات هو، على حد سواء أساليب تنطوي على خطوات كثيفة العمالة تستغرق وقتا طويلا ولكل منها بعض المخاطر من الجيل قطعة أثرية. لا طريقة مناسبة لعالية الإنتاجية عينة وتوصيف عدة آلاف من الجزيئات واحدة من عينة واحدة. وعلاوة على ذلك، والتحليل الكمي للروتين اليومي السريرية حيث توجد عينات كثير من الأحيان ليتم تحليلها في وقت واحد أو على الأقل في فترة قصيرة جدا هومن الصعب القيام بها. تقنيات الجيل الجديد يسمح لنا الآن لتحليل exosomes دون العمل التحضيري المكثف مسبق (SEM على سبيل المثال، البيئية). هذه التقنيات الحديثة لا تزال غير مريح بدلا لتحليل تعليق حجم كبيرة تحتوي على exosomes لتحديد متوسط ​​عدد وحجم التوزيع ^6.

طريقة أخرى حساسة للغاية لتصور وتحليل exosomes هو تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA). هذه الطريقة يستفيد من مبدأين مختلفة من الفيزياء. أولا، والكشف عن جسيمات من قبل الضوء المتناثرة عندما يتم المشع أنها مع شعاع الليزر. ومن المعروف أن الظاهرة الثانية كما الحركة البراونية، التي تنص على نشر جزيئات مختلفة في تعليق السائل يتناسب عكسيا مع حجمها. في الحالة الأخيرة يعتمد الحركة أيضا على درجة الحرارة واللزوجة من السوائل. ومع ذلك فإن هذه النسبة ترتبط مباشرة حجم الجسيمات ويستخدم من قبل NTA. باستخدام لينةالتحليل القائم وير، وتسجل الصور الرقمية من الضوء المتناثرة من الجزيئات واحدة. قطع من بقع الضوء المتناثرة وسرعتهم الحركة توفر البيانات التي تسهل تحديد إجمالي عدد الجسيمات وحجم التوزيع. هذه التقنية هي قوية بشكل خاص لتحليل جزيئات بقطر متوسط ​​أقل من 100 نانومتر.

يتم تنفيذ قياسات حجم وتركيز مع ZetaView البراونية وتحليل الكهربائي فيديو الحركة المجهر. وهذا هو أعلى جسيمات متناهية الصغر تحليل صك الآلي شبه مكتب للعينات السائلة (المشار إليه فيما بعد كأداة تتبع الجسيمات). وهو يتألف من جسيمات تتبع محلل وكذلك جهاز كمبيوتر محمول مع البرمجيات المستخدمة لتحليل البيانات. عينات بيولوجية غير المتجانسة هي كما مناسبة لهذا الأسلوب إلى التوقيف أكثر تجانسا من الجزيئات غير العضوية. ويستخدم المجهر نثر الليزر مع كاميرا الفيديو للكشف عن الجسيمات وللobservation من حركتهم. في حين أن محور المجهر هو أفقي وركز في القناة خلية مليئة تعليق يحتوي على exosomes، يتم توجيه شعاع الليزر عموديا. الجسيمات المشع من قبل مبعثر ضوء الليزر، والتي يتم تسجيلها تحت 90 ° بواسطة كاميرا الفيديو الرقمية عبر المجهر (الشكل 1). شدة الضوء المتناثرة تتيح مراقبة الجزيئات الكبيرة 60 نانومتر القطر. في مثل هذا الوضع سطوع الجسيمات ليست المؤشر الوحيد من حجم الجسيمات. عندما يتم تطبيق أي حقل كهربائي، حركة الجسيمات يتبع فقط الحركة البراونية ويمكن أن تكون مؤشرا لحساب حجم الجسيمات. ومع ذلك، فإن الصك هو أيضا قادرة على تطبيق مجال كهربائي عبر القناة الخلية. عندما تتعرض لهذا المجال، والمحتملين، والاستقطاب ومستوى الأيونية تهمة للexosomes علقت تصبح مزيد من محددات اتجاه حركتها. السرعة والاتجاه نتيجة في مو الكهربيبيليتي الرسم البياني.

في حين إيجاد طريقة الأمثل لتحليل exosomes معزولة هو مشكلة واحدة، وآخر يكمن في عزلة فعالة من exosomes من وسائل الإعلام المختلفة، مثل الدم، استسقاء، والبول، والحليب، والسائل الذي يحيط بالجنين أو وسائل الإعلام الخلية. وقد وصفت أساليب مختلفة حتى الآن، والتي تقوم على تنبيذ فائق ^1، الكواشف فصل الصناعية (مثل Exoquick) ^7، حبات مغناطيسية للمستضد توظيف الفصل ⁸ أو ⁹ خطوات الترشيح الفائق.

في هذا البروتوكول ونحن لشرح العملية برمتها من exosome العزلة عبر تنبيذ فائق وإظهار كيفية تحليل exosome الناتجة تحتوي على تعليق من خلال أداة تتبع الجسيمات. وتقدم اعتبارات محددة لتحليل البلازما أو زراعة الخلايا البشرية المتوسطة exosomes مشتقة.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على التجارب المعروضة في هذا العمل من قبل مجلس الأخلاقي المؤسسي للجامعة دوسلدورف.

1. إعداد Exosome

1. جمع الدم كله في 3 أنابيب سترات عبر بزل الوريد (ما مجموعه 9 مل). صب الدم في أنبوب فالكون 15 مل.
2. أجهزة الطرد المركزي في العينة 1،500 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لبدء فصل الخلايا من البلازما. نقل طاف ل15 مل جديد أنبوب الصقر.
3. أجهزة الطرد المركزي في العينة 2،800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة جميع الخلايا من البلازما (بلازما خالية من الخلايا، CFP). نقل CFP لأنابيب تنبيذ فائق، 1 مل لكل أنبوب.
4. الطرد المركزي في 100،000 x ج لمدة 90 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى نضوب exosomes. إزالة 900 ميكرولتر من طاف. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر المتبقية في أنبوب تنبيذ فائق. إضافة 900 ميكرولتر PBS.
5. الطرد المركزي مرة أخرى في 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة 900 ميكرولتر من سوpernatant. إعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر المتبقية.
6. نقل 5 إلى 20 ميكرولتر من اعادة تعليق في 40 مل من الماء المقطر. تعليق تصفية من خلال مرشح 450 نانومتر لفصل exosomes من الجزيئات الكبيرة. استخدام هذا تعليق النهائي لقياس الجسيمات.

2. إجراء بدء التشغيل من تتبع صك الجسيمات

1. بدء تشغيل البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة-البرمجيات. انقر على مختلف علامات التبويب البرمجيات ("خلية تحقق"، "قياس"، "تحليل") للتبديل بينهما في جميع أنحاء البروتوكول.
2. اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لتنفيذ الآلية الإجراء بدء التشغيل. حدد خانات الاختيار لكلا نوعية الخلايا ومحاذاة السيارات.
   ملاحظة: أي من هذه الخطوات يمكن أن تتكرر بشكل منفصل إذا لزم الأمر عن طريق زر (A) أو (B) الضغط على "الاختيار خلية" علامة التبويب.
3. فتح مدخل ومخرج منفذ الصك NTA وحقن 10 مل تقطير المياه عن طريق حقنة في القناة الخلية من خلال مدخل الميناء. إغلاق الميناء منفذا كما يتم حقن كمية الأخير من المياه. ضع الكأس تحت الميناء منفذا لجمع النفايات حل. تأكد من أن الخلية قياس خالية من فقاعات الهواء ولا المحاقن فقاعات الهواء في النظام. إغلاق مدخل الميناء على الفور.
4. إجراء فحص الجودة خلية عن طريق النقر على "OK". يقوم البرنامج بعرض نتائج نوعية الخلية بعد بضع ثوان.
5. إذا لا تزال تصور أي جزيئات في الشاشة الحية نظرا للبرمجيات أو إذا كانت نتيجة فحص الجودة جيدة فقط أو الفقيرة، يتم إزالة كرر الخطوة 2.3 حتى الجزيئات المتبقية من الخلية القياس. أكرر أيضا خطوة 2.3 بعد كل قياس لتجنب تراكم الجزيئات. إذا تكرار حقن الماء المقطر والاختيار الخلية لا يؤدي إلى نتائج "جيدة"، والمضي قدما إلى 2.9.
6. إعداد تعليق السيطرة تحتوي موحد 200 نانومتر بول الحجمالجسيمات ystyrene لاستخدامها لتحقيق المواءمة بين بؤر الليزر والمجهر. إضافة قطرة واحدة من التركيز تعليق، المقدمة من الشركة المصنعة الصك، إلى 500 مل من الماء المقطر للحصول على التركيز المطلوب بحيث يتم عرض 600 ± 100 الجسيمات في الشاشة في الرؤية الحية.
7. حقن تعليق محاذاة إلى أداة NTA كما هو موضح في الخطوة 2.3. اضغط على "موافق" لبدء محاذاة السيارات، روتين الآلي من خلالها النظام سوف تجد الموقف الأمثل للبؤر اثنين تلقائيا.
8. عند ظهور موجه يفيد هذا النظام هو الآن على استعداد لإجراء التجارب، انقر على OK لبدء القياس.
9. أحيانا، وتنظيف قناة خلية يدويا بين التجارب التي كتبها التنظيف الخلية مع حل 30٪ من الايثانول. تنظيف القناة كلما يعرض البرنامج تقريرا عن الخطأ التلقائي.

3. قياس عينة

1. مسح القناة مع الماء المقطر قبل عصامقياس عينة CH رأي (كما هو موضح في الخطوة 2.3).
2. حقن تعليق exosome (المعد في القسم 1) في إلى القناة، كما هو موضح في الخطوة 2.3.
3. ضبط المعلمات الرئيسية التالية في البرنامج حسب الحاجة:
   1. حساسية. من أجل العثور على مجموعة حساسية الأمثل، انقر على زر "عدد الجسيمات مقابل حساسية" لعرض منحنى للجسيمات قياس الشاشة في لمستويات حساسية مختلفة. اختار مستوى الحساسية قبل المنحدر الأقصى للمنحنى. مستوى حساسية أعلى يسمح التصور من المزيد من الجسيمات الصغيرة ولكن أيضا يزيد من القضايا ذات الصلة للضجيج في الخلفية.
   2. الحد الأدنى السطوع. اختار سطوع ابتداء من 20 لقياس exosome لاستخدام هذه الوظيفة كعامل تصفية. تنظيم هذه المعلمة إلى فارغة بقوة جزيئات خفيفة نثر. تنظيم ذلك وصولا الى تضخيم ضعيف تناثر القطع الأثرية. تختلف السطوع حسب الحاجة في كافة مراحل التجربة.
      ملاحظة: الجسيمات التي ضوئيةمبعثر تتداخل بقوة أكثر من اللازم ويمكن استبعادها من التحليل عن طريق الخطأ.
   3. Min و Max الحجم. وضع فلتر رقمي للقضاء على الضوضاء بكسل ومبعثر غير المرغوب فيها من جزيئات كبيرة الحجم من خلال تنظيم حجم الحد الأدنى والحد الأقصى. استخدام مجموعة من 10-500 بكسل لقياس exosomes.
   4. مصراع. ضبط الفترة الزمنية التي الكاميرا مفتوحة ل1/300 ثانية.
4. يعيش المعلمات تلا:
   1. التبديل بين الرقمية والتناظرية وجهة نظر عمل في أي لحظة عن طريق النقر على زر "لايف-الصورة".
   2. في كافة مراحل التجربة، ومراقبة شريط كثافة نثر، الذي يعرض حالة التشبع من العينة كمؤشر ونا مميزا. لا تحليل exosomes إذا كان شريط نثر أحمر. في مثل هذه الحالة مزيد من تمييع عينة لتجنب هذه الظاهرة. إذا تحظر حالة تجريبية التلاعب من العينة تعليق، أسفل تنظيم حساسية أو يصل تنظيم سطوع في برنامج لياليettings لتحسين نتائج القياس.
      ملاحظة: عندما يتم تحليل العينات مع تركيز عال جدا من الجسيمات مبعثر احتمال اشتعال الجزيئات الفردية وتحسب على أنها جسيم واحد.
   3. لاحظ عدد من الجسيمات تحسب في مجال الرؤية من العرض.
5. انقر على "القياس" علامة التبويب.
6. اختيار الإعدادات في "تشغيل خيارات" صفيف.
   1. قبل كل الاستحواذ، حدد "حركة الاختيار" لفحص المتكررة اختبار الانجراف الجسيمات. إجراء اختبار مرة واحدة على الأقل قبل البدء في تحليل كله. إذا كان الانحراف هو أعلى من 20 ميكرون / ثانية، والانتظار قبل مواصلة قياس بحيث العينة توقف تدفق.
   2. حدد عدد من التجارب (5) وتأخير الوقت بينهما (0).
   3. إجراء "فحص عينة" إذا لزم الأمر. هذا الاختبار هو جزء من محاذاة السيارات في الإجراء بدء التشغيل ويمكن أن يتكرر بعد ذلك حسب الحاجة.
7. وأخيرا انقر على زر "الاستحواذ الفيديو تشغيل". في النافذة الجديدة، وتحديد عدد الدورات (15) وعدد من المناصب القياس (11).
   ملاحظة: رئيس الليزر ويمكن نقل المجهر لتحليل عدد الجسيمات في 11 وظيفة مختلفة. اعتمادا على الطلب التجريبي، أن تقرر ما إذا كانت التجربة ينبغي أن يقوم على موقف واحد أو على مواقع مختلفة.
   1. تأكيد الحد الأدنى من المدة الزمنية جسيم لابد من تتبع ليكون بمثابة الجسيمات فرد واحد من خلال تحديد دقة الفيديو (منخفض). وهناك نتائج أقل دقة في مدة أقصر تتبع.
   2. حدد اسم الملف وانقر على "OK" لبدء القياس.

4. تفسير نتائج

1. عرض النتائج والمعلمات التالية عرض بعد القياس على "النتائج" علامة التبويب: (1) العدد الكلي للجسيمات تتبعها، (2) متوسط ​​عدد جزءاicles في الموقف، و (3) تركيز الجسيمات.
   1. عرض متوسط ​​الجدول نتيجة للنسبة العددية لحجم الجسيمات (قطر، السطحية والحجم) إلى نسبة أعداد الجسيمات، فضلا عن قيم المتوسط ​​والتمايز القياسية.
   2. استخدم الجدول تحليل ذروة الذروة في حالة وجود أكثر من واحد في التحليل البياني. هذا الجدول يبين توزيع الجسيمات التي تكون أصغر من ذروة الأولى أو الثانية على التوالي.
2. عرض الرسم البياني تحسب بعد قياس لرؤية توزيع الجسيمات من حيث الحجم. استخدام الرموز في وضع العرض وفوق الرسم البياني لتغيير الإعدادات.

النتائج

العينة المستخدمة في هذه التظاهرة معارض جو الأمثل لقياس مع وجود حساسية من 85٪، وذلك قبل المنحدر الحد الأقصى لمنحنى حساسية (الشكل 2). السطوع، ودقيقة / تم اختيار القيم كحد أقصى على النحو الموصى به في البروتوكول. وهناك تركيز 5.3 الجسيمات / مل × 10 ⁶ تم قياس، في حين كان متوسط ​​حجم الجسيمات 0.149 ميكرون، معظمهم من 0.137 ميكرون.

يمكن حفظ القيم وردت بعد قياس في تقرير مع تنسيق ملف من قوات الدفاع الشعبي أو في شكل. TXT للتصدير إلى قاعدة البيانات. يمكن تعديل الرسم البياني كما يفضل كما هو موضح في البروتوكول (القسم 4). يتم حفظ تسلسل الفيديو أيضا، ويمكن استخدامها في وقت لاحق خارج الخط إعادة التحليل. ومع ذلك، في هذا التحليل خارج الخط، إعدادات ما قبل الاستحواذ على الكاميرا لا يمكن تغيير بأثر رجعي.

من أجل العثور على إعدادات المعلمة المثلى لقياس، ونحن هنا وصف عشرالبريد تعظيم الاستفادة من إعدادات الأداة على سبيل المثال من 100 نانومتر حجم البوليسترين المعيار. وتناقش تأثير معلمتين والحساسية ودقيقة / الحد الأقصى لحجم على صورة الفيديو وحجم الجسيمات التوزيع بالتفصيل. وتتلخص جميع البارامترات الأخرى في الجدول 1.

هو تصور وانطباع البصري للتأثير الحساسية (تتراوح 50-94) على التناظرية والرقمية الصور في الشكل (3). وتقدم المعلومات الكمية المستمدة من الصور في الشكل (4)، استنادا إلى الإعدادات في الجدول رقم 1، مين الحجم = هو مبين (5) وماكس الحجم = 200. وثمة علاقة نموذجية من عدد الجسيمات الكشف مقابل حساسية في الشكل 4A. ما بين 50 و 90، وزيادة عدد جزيئات الكشف عن بحساسية وارتفع بشكل كبير عن الحساسيات> 90. تم العثور على مجموعة الأمثل للحساسية بين 66 و 86 (A). توزيع حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها مع DIFوتظهر إعدادات حساسية ferent في الشكل 4B. التوزيعات حجم الجسيمات تمثل متوسط ​​ثلاثة القياسات الفردية. لمنخفضة للغاية الحساسية (حساسية = 62، المنحنى الأحمر) وقد تم تحليل عدد قليل من الجزيئات فقط مما أدى إلى إحصاءات الفقيرة إلى حد ما. ارتفع عدد الجسيمات تحليلها مع الحساسية والتوصل إلى الحد الأمثل بين 70 (منحنى الأصفر) و 86 (منحنى تان). زيادة كذلك الرصاص حساسية إلى تدهور توزيع حجم الجسيمات مع عدد الجسيمات اسقاط وتوزيع حجم التحول نحو الأحجام الأصغر (حساسية = 94، المنحنى الأزرق). ويبين الشكل 4C اتجاه عدد مقرها قطر X50 (50٪ من جسيمات أصغر من هذا القطر) كدالة للحساسية. في الفترة الفاصلة البيج، كان RSD من حجم الجسيمات أقل من 8٪، ويتوافق مع فترة الأمثل في A. المناطق الحمراء تشير RSD> 8٪ نتيجة لإحصاءات الفقيرة (حساسية منخفضة للغاية) أو زعته واسعbutions مع التحول إلى أحجام أصغر (حساسية عالية للغاية).

إعدادات الحد الأدنى الحجم وماكس الحجم هي مرشحات تطبيقها على الصور الرقمية من أجل إزالة الجزيئات مع أحجام نقطة أصغر من الحد الأدنى الحجم وأكبر من ماكس الحجم. بسبب القدرة على تبعثر الضوء، الجسيمات يخلق بقعة من حجم معين على صورة رقمية. يتم قياس حجم البقعة وعدد من بكسل (بكسل). عندما ينثر جسيم الضوء بشكل جيد للغاية (على سبيل المثال، والجسيمات> 200 نانومتر أو المجاميع)، وحجم البقعة هو كبير جدا، على سبيل المثال،> 500 بكسل. حجم بقعة صغيرة جدا (على سبيل المثال، <10 بكسل) للجسيمات صغيرة (على سبيل المثال، <20 نانومتر) اعتمادا على المواد الجسيمات. حجم البقعة (بكسل) قد لا يكون متبادل مع حجم الجسيمات (نانومتر) لأنها ليست متطابقة وليس هناك علاقة مباشرة بين هذين المتغيرين. لتعظيم الاستفادة من الحد الأدنى والحد الأقصى الحجم يسمح للمستخدم لتصفية الأشياء غير المرغوب فيها مثل الكتل (ماكس الحجم) أو صغيرةكائنات مثل الضوضاء الخلفية (مين الحجم). ويظهر تأثير مين / ماكس الحجم على توزيع حجم الجسيمات من حجم قياسي 100 نانومتر في الشكل 4D (حساسية = 82). عندما يتم تعيين الفاصل الزمني إلى أحجام بقعة صغيرة (على سبيل المثال، دقيقة = 1، الحد الأقصى = 52؛ منحنى البرتقال)، ينخفض ​​عدد الجسيمات تحليلها ويتم إزاحة عدد مقرها قطر X50 قليلا نحو الأحجام الأصغر. إعداد لبقع أكبر (دقيقة = 40، الحد الأقصى = 1،000، المنحنى الأحمر) النتائج في توزيع حجم الجسيمات واسع تحول نحو أحجام أكبر. من أجل الحصول على الأرقام الإجمالية متساوية من الجسيمات، تم تعديل الحدود الفاصلة التوزيعات على حد سواء البرتقالي والأحمر لمباراة 80 الجسيمات. توزيع مع الإعدادات المثلى (دقيقة = 5، الحد الأقصى = 200؛ منحنى تان) ويتكون من 360 الجسيمات.

وأجريت سلسلة من التجارب الناجحة مع exosomes معزولة بسبب تنبيذ فائق ويقاس NTA باستخدام نظام المقدمة. وكانت البيانات الناتجة غايةبما يتفق وأكد على مستوى عال من التكاثر. يجب أساليب عزل أخرى تظهر نتائج مماثلة. ومع ذلك، تم تحديد الخطوة تخفيف كخطوة حاسمة بشكل خاص وتأثيرها على الأرقام الإجمالية المحسوبة للجسيمات لابد من إعادة تقييم.

الشكل 1. تخطيطي من الإعداد للNTA. والموجه المجهر / محور الفيديو وشعاع الليزر متعامد مع بعضها البعض، وعبور في المقطع العرضي قناة الخلية. يتم عرض الضوء المتناثرة من الجزيئات في "العيش رأي" نافذة البرنامج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. عدد الجسيمات مقابل منحنى حساسية. يعرض عدد من الجسيمات مقابل منحنى حساسية الجسيمات في موقف واحد في لحظة واحدة خلال مسح حساسية التلقائي. ويستخدم هذا التصور رسومية لتحديد أفضل التفضيلات الخاصة القياسات الأولية. يتم اختيار قيمة حساسية قبل المنحدر الحد الأقصى من الرسم البياني. من المهم أن نتذكر أن القطع الأثرية لا القضاء في هذه التجربة اختبار ويمكن أن تؤثر على الرسم البياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم عرض الشكل 3. تأثير الحساسية على التناظرية وصورة رقمية. التصور من الجزيئات التي تظهر على الشاشة رأي الحية لحساسيات بين 50 و 94 لكل من التناظرية (الصف العلوي) لد الرقمية آراء (الصف السفلي). عندما حساسية منخفضة جدا، يتم الكشف سوى عدد قليل من الجسيمات (يسار). في حساسية الأمثل تظهر الجسيمات النقاط واحدة كما معزولة جيدا عن بعضها البعض (وسط). في دمج الجسيمات حساسية عالية نسبيا تؤدي معا إلى سوء جودة الصورة (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. تأثير حساسية دقيقة وإعدادات حجم الحد الأقصى لعينة السيطرة 100 نانومتر البوليسترين الجسيمات (A) قطعة حساسية في مقابل الكشف عن عدد من الجسيمات؛ الفترة الأمثل هو 66-86، قبل المنحدر الأقصى للمنحنى. توزيعات (B) حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها مع العديد من إعدادات الحساسية (62-94)؛ الرسوم البيانية لمنخفضة جدا (62) أو مرتفعة جدا (94) حساسية لا تلتقط توزيع حجم الجسيمات ل100 نانومتر العينة الضابطة البوليسترين. (C) عدد مقرها X50 قطر مقابل حساسية. الخطأ من X50 في الفترة الفاصلة البيج هو أقل من 8٪، فاصل الأمثل هو من 66 إلى 86. (D) أثر Min و Max الحجم على توزيع حجم الجسيمات. المعلمات المثلى (دقيقة = 5 و الحد الأقصى = 200) التقاط التوزيع الصحيح للالعينة الضابطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المعلمات ما قبل الاستحواذ
حساسية	متغير
مصراع	40
معدل الإطار	30 إطارا في الثانية
قرار	مرحباGH
دورات	10
الاستحواذ متعددة	3
موقف	1
المعلمات في مرحلة ما بعد الاستحواذ
دقيقة السطوع	30
ماكس الحجم	متغير
دقيقة الحجم	متغير

الجدول 1. ملخص من المعلمات قبل وبعد اكتساب لوضع وثيقة تتبع الجسيمات.

Discussion

علينا أن نظهر بروتوكول مفصلة لعزل exosome من الدم والحاضر تتبع جسيمات متناهية الصغر باعتبارها الرواية وطريقة مبتكرة لقياس حجم exosome والتركيز في السائل البيولوجي. في التجارب المعروضة تم استخدام الدم المحيطي البشري وأصل exosomes. ومع ذلك، أصول أخرى، مثل البول، البلغم، وزراعة الخلايا طاف وغيرها، ويمكن أيضا أن تستخدم كمادة اختبار.

على أساس التباين البيولوجي للتركيز exosome في البشر، قد المقايسات من مختلف الأفراد ميزة تركيز متفاوتة بشكل ملحوظ من exosomes. ومع ذلك، فإن تركيز الجزيئات في اختبار التحقيق البيولوجي قد يكون لها تأثير على النتائج. ولذلك، هناك حاجة إلى نهج موثوق وموحد لتخفيف من تحقيقات. في طريقة عرض تم إنشاؤها exosome تحتوي البلازما من 9 مل من الدم الكامل الطرفية. باستخدام الطرد المركزي التفاضلي الخطوات تم عزل بيليه exosome من 1 مل البلازما وإعادة وقف التنفيذ في 5 مل من الماء المقطر أن يؤدي في العينة عمل exosomes مع وقف التنفيذ. وقد وفرت هذا الإعداد محددة مسبقا لنا مع تركيز السليم للجزيئات، أي كثافة مبعثر المناسبة أثناء NTA. بجانب حجم والتخفيف الجانب، وتكوين الحلول التي تستخدم أيضا من أهمية. وقد استخدمنا الماء المقطر لنهائي اعادة تعليق من exosomes. وبطبيعة الحال، وسائل الإعلام المختلفة للخطوة التخفيف النهائية يمكن أن تستخدم أيضا، وفقا لمتطلبات التجريبية مجموعة المتابعة. ومع ذلك، في حالة القياسات زيتا المحتملة من الحلول الأيونية، وخاصة عند اختبار عينات بسعة التخزين المؤقت، والتخفيف من الحكمة في ظروف خالية الاضطراب مفيد. للمقارنة مباشرة من عينات متعددة نوصي الحفاظ على مستوى التخفيف نفسه لجميع العينات. يمكن تغيير جميع إعدادات باستثناء حساسية ودقة الفيديو بعد ذلك باستخدام برنامج التحليل ZetaView.

"jove_content"> على الرغم من أن الكتاب يعتقدون أن النظام قدم هنا يمثل حاليا الصك الأنسب، أنها ليست متوفرة نظام NTA الوحيد. وهناك عدد من التقارير السابقة قد استخدمت النظم الأخرى التي تطبق مبادئ NTA نفسها ولكن توفير تصميم آخر الصك الذي يسير جنبا إلى جنب مع بعض الميزات المختلفة ^10. ونحن نعتقد أن الجوانب العملية المتعلقة التعامل مع العينة واستنساخ نتائج ذات أهمية مركزية في اختيار تسلسل منهجي لتقييم exosome. ونحن نعتقد أيضا أن نظام الكشف المثالي يجب القضاء على عوامل اعتمادا المستخدم التي قد تتداخل مع نتائج القياسات. نهج تحليل exosome أن يرد هنا يفي معيار سهولة التعامل بدرجة عالية. باعتبارها ميزة أخرى، يتم إجراء التحليل الآلي شبه من العينات في عملية سريعة، وتوليد النتائج في وقت قصير. والتصور عبر الإنترنت من exosomes الايدز محلل لالجافي فكرة الفورية من الخصائص exosome، على سبيل المثال، وتركيز الإجمالي.

إضافة بسيطة جدا ولكن أنيقة لتقنية قياس المقدمة هنا هي استخدام الأجسام المضادة المسمى exosomes والقبض على شعاع الليزر المنتشرة باستخدام فلتر السابق أمام كاشف. وبهذه الطريقة يمكن التمييز بين المجموعات السكانية الفرعية exosome وفقا لمستضدات السطحية وخصائصها الأخرى ذات الصلة من الناحية البيولوجية التي يمكن الوصول إليها من الناحية الفنية إلى تلطيخ الفلورسنت انتقائي.

عيب واحد من الإصدار الحالي من لدينا أداة تتبع الجسيمات هو حقيقة أنه في مستويات حساسية عالية جدا التحف مثل الضوضاء الخلفية قد تصبح الحالي، الذي يقوم على الجدار قناة الخلية. قد يصبح الحل التقني وتحسين للنظام الحالي متاحة في المستقبل القريب. بواسطة هذه الطريقة انعكاسات ضوء الليزر مبعثر على الحائط القناة سيتم تخفيض، وبالتالي زيادة دقة الإشارات قياس والبيانات التي تم الحصول عليها وخفض الحد من الكشف.

على الرغم من أن البروتوكول المستخدم حاليا لexosome العزلة راسخة وتطبيق أداة تتبع الجسيمات لديه قرار دقيقة بشكل ملحوظ مع توزيع حجم أقل من 30 نانومتر، ليس هناك ما يضمن أن الجسيمات الكشف هي في الواقع exosomes حقيقية تماما. الجزيئات الأخرى، مثل شظايا خلية ميتة أو مجمعات البروتين أكبر قد تكون أيضا موجودة في تعليق exosome وتؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة. واحد طريقة موثوق بها التي من هذا القبيل "التلوث" يمكن استبعادها قد يكون المجهر الإلكتروني (EM)، إما EM نقل أو مسح EM. للأسف، لم يتم التعرف على علامة العامة والخاصة لexosomes حتى الآن، على الرغم من أن عددا من علامات سطح المقترحة سابقا اكتسبت قدرا متزايدا من الاهتمام، بما في ذلك tetraspanin (Tspan)، CD81، C63، CD9، الخ ^11.

"> وبغض النظر عن التقدم في المستقبل من البحوث حول علم الأحياء exosome، ولا سيما فيما يتعلق علامات محددة exosome، فإن البروتوكول الذي يرد هنا توفر وسيلة قوية لعزل والكشف عن exosomes. يمكن تحديد تركيز وحجم بسهولة في المساعدة البرمجيات سوف الأزياء واضحة. وإضافة علامات الفلورسنت انتقائية أو fluorophore إلى جانب الأجسام المضادة من المرجح زيادة تعزيز التطبيقات الممكنة للنهج قدمت من NTA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citrate tube	BD	364305	BD Vacutainer
Distilled water	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia
Falcon tube	Greiner Bio One	188271	PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugation tube	Beckman	357448	Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2.6% Solids-Latex Alignment Solution
Syringe (Filter)	Braun	4617053V	5 ml
Syringe (ZetaView)	Braun	4606051V	5 ml
Needle	BD	305180	BD Blunt Fill Needle
Filter	Sartorius Stedim	16555	Syringe filter, hydrophilic, 450 µm
Ultracentrifuge	Beckman	L8-M	Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type 101
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Rotor: A-4-44