Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Riepilogo

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Abstract

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.

Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.

Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

Introduzione

L'esatta funzione di exosomes circolanti rimasto sconosciuto per un lungo periodo di tempo. Anche ora il meccanismo percorso completo di esosomi non è del tutto chiaro. Dal esosomi portano antigeni, proteine ​​e RNA (mRNA e miRNA), che li riferisce alla loro cella genitori di origine, la loro funzione come trasmettitori di segnalazione cellula-cellula è principalmente stata data la priorità.

Molti metodi differenti sono stati descritti in letteratura per l'isolamento e la determinazione quantitativa di esosomi ^1,2. Tuttavia, nessun consenso su un 'gold standard' è stato raggiunto. Nel frattempo la maggioranza degli scienziati attivi nel campo della ricerca exosome concordano che un metodo coerente di isolamento è altamente giustificato per raggiungere un grado di comparabilità tra i diversi rapporti e studi più elevato.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è lo strumento più comune e diffusa per l'analisi exosome ^3. FACS ha benEFIT che, tramite l'etichettatura di fluorescenza, le cellule di diversa provenienza possono essere confrontati in un solo passo. I principali svantaggi di FACS sono che questo metodo non è abbastanza sensibile per identificare le particelle inferiori a 0,5 micron ^4, considerando exosomes sono generalmente compresi tra 30-120 nm di diametro ^5, ancor meno per misurare le loro dimensioni.

Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono altri strumenti per l'analisi della dimensione delle particelle e la morfologia di esosomi. Tuttavia, sia SEM e TEM hanno lo svantaggio che la preparazione dei campioni è, entrambi i metodi coinvolgono fasi intensità di lavoro che richiede tempo e ciascuno ha un certo rischio di generazione manufatto. Né metodo è adatto per un'elevata produttività e caratterizzazione di diverse migliaia di singole particelle di un campione. Inoltre, un'analisi quantitativa per clinica routine in cui i campioni devono spesso essere analizzati simultaneamente o almeno in un periodo molto breve èdifficile da eseguire. Tecniche di nuova generazione permettono ora di analizzare esosomi senza un intenso lavoro preparatorio prima (SEM esempio, ambientale). Queste tecniche moderne sono ancora piuttosto scomodo per l'analisi di grandi volumi contenenti sospensioni esosomi per determinare il loro numero medio e distribuzione delle dimensioni ^6.

Un altro metodo molto sensibile per la visualizzazione e l'analisi di esosomi è-nanoparticelle tracciamento analisi (NTA). Questo metodo sfrutta due diversi principi di fisica. In primo luogo, le particelle vengono rilevati dalla luce dispersa quando vengono irradiate con un raggio laser. Il secondo fenomeno è noto come moto browniano, secondo cui la diffusione di particelle differenti in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. In quest'ultimo caso il movimento dipende anche dalla temperatura e dalla viscosità del liquido. Tuttavia, questo tasso è direttamente correlata alla dimensione delle particelle ed è utilizzato da NTA. Utilizzando morbidoanalisi basata-ware, immagini digitali di luce diffusa da singole particelle sono registrati. Piazzole di punti luce sparsi e la loro velocità di movimento forniscono dati che facilitano la determinazione del conteggio particellare totale e distribuzione delle dimensioni. Questa tecnica è particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm.

Le dimensioni e la concentrazione misurazioni vengono effettuate con il ZetaView browniano e elettroforesi Motion Video Analysis microscopio. Si tratta di un banco di top nanoparticella strumento di analisi semi-automatico per campioni liquidi (di seguito denominato strumento di monitoraggio di particelle). Consiste dell'analizzatore particle tracking e un computer portatile con il software utilizzato per l'analisi dei dati. Campioni biologici eterogenei sono adatti per questo metodo come sospensioni più omogenei di particelle inorganiche. Un microscopio laser scattering con una videocamera viene utilizzata per il rilevamento di particelle e per la observation del loro movimento. Mentre l'asse orizzontale e microscopio è concentrata nel canale cella riempita con una sospensione contenente esosomi, il raggio laser è orientato verticalmente. Le particelle irradiate dalla dispersione laser la luce, che viene registrata meno di 90 ° da una videocamera digitale attraverso il microscopio (Figura 1). L'intensità della luce diffusa consente l'osservazione di particelle più grandi di 60 nm di diametro. In una tale impostazione di luminosità di una particella non è l'unica indicazione della dimensione delle particelle. Quando viene applicato alcun campo elettrico, il movimento delle particelle segue solo moto browniano e può servire come indicatore per il calcolo delle dimensioni delle particelle. Tuttavia, lo strumento è in grado di applicare un campo elettrico attraverso il canale della cella. Quando sono sottoposti a questo campo, il potenziale, polarità e livello di ionica-carica delle exosomes sospesi diventano ulteriori determinanti della direzione del loro movimento. Velocità e direzione risultato in un mo elettroforeticobilità istogramma.

Mentre trovare un metodo ottimale per analizzare exosomes isolato è un problema, un altro sta nella effettiva isolamento di exosomes di diversi mezzi, come sangue, ascite, urina, latte, liquido amniotico o supporto cellulare. Sono stati descritti finora metodi diversi, che si basano su ultracentrifugazione ^1, reagenti di separazione industriali (come Exoquick) ^7, sfere magnetiche per l'antigene che impiegano la separazione ⁸ o ultrafiltrazione passi ^9.

In questo protocollo dimostriamo l'intero processo di isolamento exosome via ultracentrifugazione e mostrare come analizzare il exosome conseguente sospensione contenente attraverso lo strumento di monitoraggio delle particelle. Sono fornite considerazioni specifiche per l'analisi delle medie plasma o coltura cellulare umana esosomi derivati.

Protocollo

NOTA: Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati approvati dal Consiglio etico istituzionale dell'Università di Dusseldorf.

1. Exosome Preparazione

1. Raccogliere il sangue intero in 3 tubi citrato via venipuntura (totale di 9 ml). Versare il sangue in una provetta Falcon 15 ml.
2. Centrifugare il campione a 1500 xg per 20 min a 4 ° C per avviare la separazione delle cellule dal plasma. Trasferire il surnatante in una nuova provetta falco 15 ml.
3. Centrifugare il campione a 2.800 xg per 20 min a 4 ° C per rimuovere tutte le cellule dal plasma (plasma privo di cellule; CFP). Trasferire il PCP ai tubi ultracentrifugazione, 1 ml per provetta.
4. Centrifugare a 100.000 xg per 90 min a 4 ° C per esaurire esosomi. Togliere 900 ml di surnatante. Risospendere il pellet in restanti 100 microlitri nel tubo ultracentrifugazione. Aggiungere 900 microlitri PBS.
5. Centrifugare nuovamente a 100.000 xg per 30 min a 4 ° C. Togliere 900 ml di supernatant. Risospendere il pellet con i restanti 100 ml.
6. Trasferimento 5 a 20 ml di risospensione in 40 ml di acqua distillata. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 450 nm per separare exosomes da particelle più grandi. Con tale sospensione finale di misura delle particelle.

2. Procedura di avvio del Particle strumento di monitoraggio

1. Avviare il programma facendo doppio clic sul software-icon. Clicca sulle varie schede software ("Cell Check", "misura", "Analisi") per passare tra di loro in tutto il protocollo.
2. Seguire le istruzioni sullo schermo per un'implementazione automatica della procedura di avvio. Selezionare le caselle di controllo, sia per la qualità delle cellule e l'allineamento automatico.
   NOTA: Uno di questi passaggi può essere ripetuta a parte, se necessario, il tasto (A) o (B) Premendo la linguetta "Controllo delle celle".
3. Aprire l'ingresso e la porta di uscita dello strumento NTA e iniettare 10 ml acqua distillata dalla siringa nel canale della cella attraverso la porta di ingresso. Chiudere la luce di uscita come ultima quantità di acqua viene iniettata. Collocare un bicchiere sotto la luce di uscita per raccogliere soluzione di scarto. Assicurarsi che la cella di misura è priva di bolle d'aria e non siringa bolle d'aria nel sistema. Chiudere immediatamente la porta di ingresso.
4. Eseguire il controllo di qualità cella facendo clic su "OK". Il software visualizza i risultati qualitativi cella dopo pochi secondi.
5. Se le particelle sono ancora visualizzati nella schermata live-view del software o se il risultato del controllo qualità è solo buona o cattiva, ripetere il punto 2.3 fino a quando le particelle rimanenti vengono rimossi dalla cella di misura. Ripetere anche il punto 2.3 dopo ogni misura per evitare l'accumulo di particelle. Se ripetendo l'iniezione di acqua distillata e controllo delle cellule non produce un risultato "buono", procedere alla 2.9.
6. Preparare una sospensione di controllo contenente uniforme 200 pol nm dimensioniparticelle ystyrene da utilizzare per allineare i fuochi del laser e microscopio. Aggiungere una goccia della sospensione concentrata, fornita dal costruttore dello strumento, a 500 ml di acqua distillata per ottenere la concentrazione richiesta tale che 600 ± 100 particelle vengono visualizzati per schermo nel live-view.
7. Iniettare la sospensione allineamento nello strumento NTA come descritto al punto 2.3. Premere "OK" per avviare l'allineamento automatico, una routine automatizzata attraverso il quale il sistema troverà automaticamente la posizione ottimale dei due fuochi.
8. Quando viene visualizzato un prompt che indica il sistema ora è pronto per esperimenti, fate clic su OK per avviare la misurazione.
9. Occasionalmente, pulire il canale della cella manualmente tra esperimenti svuotando la cella con una soluzione al 30% di etanolo. Pulire il canale ogni volta che il software viene visualizzato un rapporto di errore automatica.

3. Misurazione del campione

1. Lavare il canale con acqua distillata prima eamisurazione del campione ch (come descritto nel passaggio 2.3).
2. Iniettare la sospensione exosome (preparata al punto 1) per canale, come descritto al punto 2.3.
3. Regolare i seguenti parametri principali del software in base alle esigenze:
   1. Sensibilità. Al fine di trovare la gamma di sensibilità ottimale, fare clic sul pulsante "numero di particelle vs Sensitivity" per visualizzare una curva per particelle misurate per schermo per diversi livelli di sensibilità. Abbiamo scelto un livello di sensibilità prima della massima pendenza della curva. Un livello maggiore sensibilità permette la visualizzazione di particelle più piccole, ma aumenta anche le questioni relative al rumore di fondo.
   2. Luminosità minima. Abbiamo scelto una luminosità iniziale di 20 per la misura exosome utilizzare questa funzione come filtro. Regolare questo parametro fino a vuoto con forza le particelle di luce-dispersione. Regolare il basso per amplificare debolmente dispersione artefatti. Variare la luminosità secondo necessità durante l'esperimento.
      NOTA: Le particelle che leggeriScatter troppo forte sovrapposizione e possono essere esclusi dall'analisi per errore.
   3. Min e Max Size. Impostare un filtro digitale per eliminare il rumore dei pixel e dispersione indesiderata da particelle di grandi dimensioni, regolando la dimensione minima e massima. Utilizzare un intervallo di 10 a 500 pixel per la misurazione di esosomi.
   4. Shutter. Regolare il periodo di tempo che la fotocamera è aperta a 1/300 sec.
4. Vivere parametri letti fuori:
   1. Passare da una digitale e una vista modus analogico in qualsiasi momento cliccando sul tasto "Live-immagine".
   2. Durante l'esperimento, monitorare la barra Intensity dispersione, che visualizza lo stato di saturazione del campione come indicatore colore codificato. Non analizzare exosomes se la barra di dispersione è rossa. In tal caso diluire ulteriormente il campione per evitare questo fenomeno. Se la condizione sperimentale vieta una manipolazione della sospensione del campione, down-regolare la sensibilità o up-regolare la luminosità nel software-smpostazioni per migliorare i risultati della misurazione.
      NOTA: Quando si analizzano campioni con una altissima concentrazione di particelle della dispersione si fondono singole particelle e sono contati come una singola particella.
   3. Si noti il ​​numero di particelle contate nel campo visivo dal display.
5. Fare clic sulla scheda "Misura".
6. Scegliere le impostazioni della matrice "opzioni di esecuzione".
   1. Prima di ogni acquisizione, selezionare "movimento di controllo 'per un controllo ripetuto di prova della deriva delle particelle. Eseguire il test almeno una volta prima di iniziare l'intera analisi. Se la deriva è superiore a 20 um / sec, attendere prima di continuare la misura in modo che il campione non scorre.
   2. Selezionare il numero di esperimenti (5) e il ritardo di tempo tra loro (0).
   3. Eseguire un "controllo a campione ', se necessario. Questo test è parte dell'allineamento automatico nella procedura di avvio e può essere ripetuto in seguito come necessario.
7. Infine, fare clic sul pulsante "acquisizione video di funzionare". Nella nuova finestra, definire il numero di cicli (15) e il numero di posizioni di misura (11).
   NOTA: La testa laser e il microscopio può essere spostato per analizzare il numero di particelle a 11 posizioni diverse. Secondo la richiesta sperimentale, decide se l'esperimento deve essere eseguita su una posizione singola o su posizioni diverse.
   1. Confermare la durata minima di tempo una particella deve essere rintracciato da contare come una singola particella, impostando la risoluzione video (basso). Una risoluzione inferiore a una durata più breve inseguimento.
   2. Selezionare un nome-file e fare clic su "OK" per avviare la misurazione.

4. Interpretazione dei risultati

1. Guarda i seguenti risultati ei parametri visualizzati dopo la misurazione sulla scheda "risultati": (1) il numero totale di particelle tracciato, (2) numero medio di parteicles per la posizione, e (3) la concentrazione di particelle.
   1. Visualizzare la tabella media risultato del rapporto numerico delle dimensioni delle particelle (diametro, di superficie e volume) alla percentuale di numeri di particelle, nonché i valori di media e differenziazione standard.
   2. Utilizzare la tabella di analisi di picco se più di un picco esiste nella analisi grafica. Questa tabella mostra la distribuzione di particelle di dimensioni inferiori al primo o rispettivamente secondo picco.
2. Guarda il grafico calcolato dopo la misurazione di vedere una distribuzione delle particelle in base alle dimensioni. Utilizzare le icone in modalità di visualizzazione e sopra il grafico per modificare le impostazioni.

Risultati

Il campione utilizzato per questa dimostrazione mostra un ambiente ottimale per la misura con una sensibilità del 85%, prima della massima pendenza della curva di sensibilità (Figura 2). La luminosità, il min / max valori sono stati scelti come raccomandato nel protocollo. Una concentrazione di 5,3 particelle / ml x 10 ⁶ è stata misurata, mentre la dimensione media delle particelle era 0,149 micron, la maggior parte erano 0,137 micron.

I valori ricevuti dopo la misurazione possono essere salvati in un report con un formato di file .pdf o come .txt per l'esportazione in un database. Il grafico può essere regolata a piacere, come descritto nel protocollo (sezione 4). La sequenza video viene inoltre memorizzato e può essere utilizzato per più tardi off-line rianalisi. Tuttavia, in tale analisi off-line, le impostazioni pre-acquisizione della fotocamera non possono essere modificate con effetto retroattivo.

Per trovare le impostazioni dei parametri ottimali per una misura, noi qui descriviamo the ottimizzazione delle impostazioni dello strumento sulla esempio di un formato di polistirene standard 100 nm. L'influenza di due parametri, sensibilità e min / max dimensioni sull'immagine video e granulometria distribuzione è discusso in dettaglio. Tutti gli altri parametri sono riassunti in Tabella 1.

Una impressione visiva dell'impatto della sensibilità (da 50 a 94) sulle immagini analogiche e digitali è visualizzato in Figura 3. Le informazioni quantitative derivate dalle immagini è presentato nella Figura 4, in base alle impostazioni della Tabella 1, Dimensione min = 5 e Max Size = 200. Un tipico rapporto del numero di particelle rilevate vs sensibilità è mostrato in Figura 4A. Tra 50 e 90, il numero di particelle rilevate aumentato con sensibilità e aumentato drammaticamente per sensibilità> 90. È stato trovato un intervallo ottimale di sensibilità tra 66 e 86 (A). Granulometrie ottenuti con difimpostazioni di sensibilità ferenti sono illustrati nella Figura 4B. Le distribuzioni granulometriche rappresentano la media di tre misurazioni individuali. Per troppo bassa sensibilità (sensibilità = 62, curva rossa) sono stati analizzati solo poche particelle causando statistiche piuttosto poveri. Il numero di particelle analizzati aumentata con sensibilità e raggiunto un ottimale tra 70 (curva gialla) e 86 (curva tan). Aumentando ulteriormente il vantaggio sensibilità ad un deterioramento della distribuzione granulometrica con il numero di particelle che cadono e distribuzione dimensionale spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità = 94, curva blu). La figura 4C mostra l'andamento del diametro x50 basato sul numero (50% particelle sono più piccole di questo diametro) in funzione della sensibilità. Nell'intervallo beige, l'RSD delle dimensioni delle particelle è inferiore all'8% e corrisponde all'intervallo ottimale in A. Le regioni rosse indicano RSD> 8% a causa di statistiche poveri (sensibilità troppo bassa) o ampia distributi con spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità troppo alta).

Le impostazioni di Dimensione min e Max Size sono filtri applicati alle immagini digitali, al fine di rimuovere le particelle di dimensioni inferiori a pronti Dimensione min e più grandi di Max Size. Grazie alla capacità di diffondere la luce, una particella crea un punto di una certa dimensione in una immagine digitale. La dimensione dello spot è misurato come numero di pixel (px). Quando una particella diffonde la luce molto bene (ad esempio, particelle> 200 nm o inerti), la dimensione del punto è abbastanza grande, ad esempio,> 500 px. La dimensione del punto è piuttosto piccola (ad esempio, <10 px) per le piccole particelle (ad esempio, <20 nm) a seconda del materiale particellare. Dimensioni Spot (px), non può essere scambiato con granulometria (nm), in quanto non sono identici e non vi è alcun rapporto diretto tra queste due variabili. Un'ottimizzazione di Min e Max Size permette all'utente di filtrare gli oggetti indesiderati come agglomerati (Dimensione massima) o piccolooggetti come rumore di fondo (Dimensione min). L'influenza di Min / Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle di dimensioni standard 100 nm è mostrato in Figura 4D (sensibilità = 82). Quando l'intervallo è impostato su piccoli formati in loco (ad esempio, min = 1, max = 52; curva arancione), il numero di particelle analizzate si riduce e il diametro x50 basato numero è leggermente spostata verso dimensioni più piccole. Un ambiente per le macchie più grandi (min = 40, max = 1.000; curva rossa) si traduce in una vasta distribuzione granulometrica spostata verso formati più grandi. Al fine di ottenere la parità di numero totale di particelle, i confini di intervallo delle distribuzioni sia arancione e rosso sono stati adeguati in base 80 particelle. La distribuzione con le impostazioni ottimali (min = 5, max = 200; curva tan) è composto da 360 particelle.

Una serie di esperimenti sono stati eseguiti con successo esosomi isolato mediante ultracentrifugazione e misurati da NTA utilizzando il sistema presentato. I dati risultanti erano altamentecoerente e confermato un elevato livello di riproducibilità. Altri metodi di isolamento dovrebbe mostrare risultati simili. Tuttavia, la fase di diluizione è stato identificato come un passo particolarmente critico e il suo impatto sul numero totale calcolato di particelle deve essere rivalutato.

Figura 1. Schema del setup della NTA. L'asse microscopio / video e laser sono orientati ortogonalmente tra loro, attraversano la sezione trasversale canale della cella. Luce diffusa dalle particelle viene visualizzato nella finestra "live-view" del software. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Numero di particelle vs curva di sensibilità. Il numero di particelle vs curva di sensibilità mostra le particelle in una posizione in un momento durante una scansione automatica della sensibilità. Questa visualizzazione grafica viene utilizzata per determinare le migliori preferenze per le misurazioni iniziali. Un valore di sensibilità viene scelto prima alla massima pendenza del grafico. E 'importante ricordare che gli artefatti non sono eliminati in questo esperimento di prova e possono influenzare il grafico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Impatto di sensibilità da analogico e digitale delle immagini. Visualizzazione di particelle sullo schermo live view viene visualizzato per sensibilità tra 50 e 94 sia analogica (riga in alto) und vista digitali (fila in basso). Quando la sensibilità è troppo bassa, solo poche particelle vengono rilevati (a sinistra). Alla sensibilità ottimale le particelle appaiono come singoli punti e isolati gli uni dagli altri (al centro). A un relativamente elevati particelle sensibilità si fondono portando ad una scarsa qualità dell'immagine (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Influenza delle impostazioni di dimensione max sensibilità min e per un campione di controllo di 100 nm polistirolo particelle (A) Trama di sensibilità in funzione del numero rilevato di particelle.; l'intervallo ottimale è 66-86, prima della massima pendenza della curva. Distribuzioni (B) dimensione delle particelle ottenute con diverse impostazioni di sensibilità (62-94); grafici per troppo bassa (62) o troppo alto (94) sensibilità non catturano la distribuzione delle dimensioni delle particelle per il campione di controllo polistirene 100 nm. (C) Numero basato diametro x50 contro sensibilità; l'errore di x50 nell'intervallo beige è inferiore a 8%, intervallo ottimale è da 66 a 86. (D) Effetto Min e Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle; parametri ottimali (min = 5 e max = 200) catturano la distribuzione corretta per il campione di controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Parametri pre-acquisizione
Sensibilità	variabile
Otturatore	40
Frame rate	30 fps
Risoluzione	Ciaogh
Cicli	10
Più Acquisizioni	3
Posizione	1
Parametri post-acquisizione
Min Luminosità	30
Max Size	variabile
Min Size	variabile

Tabella 1. Sintesi dei parametri pre e post-acquisizione per l'impostazione dello strumento di monitoraggio delle particelle.

Discussione

Dimostriamo un protocollo dettagliato per l'isolamento exosome dal sangue e presente tracciamento nanoparticelle come un romanzo e metodo innovativo per misurare le dimensioni exosome e concentrazione in un fluido biologico. Negli esperimenti presentati sangue periferico umano è stato utilizzato come origine dei esosomi. Tuttavia, altre origini, quali urina, espettorato, supernatante di coltura cellulare, ecc, possono essere utilizzati anche come materiale di prova.

Sulla base della variabilità biologica di concentrazione exosome negli esseri umani, test di diversi individui possono caratterizzato da una notevole variabile concentrazione di esosomi. Tuttavia, la concentrazione di particelle nella sonda di test biologico può avere un impatto sui risultati. Pertanto, è necessario un approccio affidabile e standardizzato per la diluizione di sonde. Nel metodo presentato exosome contenente plasma è generato da 9 ml di sangue intero periferico. Utilizzando centrifugazione differenziale passaggi un pellet exosome stato isolato da1 ml di plasma e risospeso in 5 ml di acqua distillata per portare nel campione di lavoro di esosomi sospesi. Questa impostazione predefinita ci ha fornito una corretta concentrazione di particelle, cioè, intensità scatter appropriato durante NTA. Accanto all'aspetto volume e diluizione, la composizione delle soluzioni che vengono utilizzati è anche di importanza. Abbiamo usato l'acqua distillata per la finale risospensione di esosomi. Naturalmente, possono anche essere utilizzati diversi supporti per la fase di diluizione finale, secondo le esigenze del set-up sperimentale. Tuttavia, nel caso di misure potenziali zeta di ionici-solutions, soprattutto nelle prove campioni con una capacità tampone, una diluizione prudente condizioni liberi turbolenza è utile. Per il confronto diretto di più campioni si consiglia di mantenere lo stesso livello di diluizione per tutti i campioni. Tutte le impostazioni, tranne la sensibilità e la risoluzione video possono essere modificate in seguito utilizzando il software di analisi ZetaView.

Sebbene gli autori ritengono che il sistema introdotto qui rappresenta attualmente lo strumento più idoneo, non è l'unico sistema NTA disponibili. Una serie di studi precedenti hanno impiegato altri sistemi che applicano gli stessi principi NTA ma forniscono un altro disegno strumento che va di pari passo con alcune caratteristiche diverse ^10. Riteniamo che gli aspetti pratici relativi alla manipolazione del campione e la riproducibilità dei risultati sono di importanza centrale nella scelta della sequenza metodologica per la valutazione exosome. Riteniamo inoltre che un sistema di rilevamento ideale dovrebbe eliminare i fattori dall'utente a seconda che possono interferire con i risultati delle misurazioni. L'approccio di analisi exosome che viene presentato qui soddisfa il criterio di maneggevolezza per un alto grado. Come ulteriore vantaggio, l'analisi semiautomatica dei campioni viene eseguita in un processo rapido, generando risultati in breve tempo. Una visualizzazione online esosomi aiuta l'analizzatore di gain un'idea istante delle caratteristiche exosome, ad esempio, la concentrazione lordo.

Un semplice ma elegante aggiunta alla tecnica di misura qui presentato è l'uso di anticorpo marcato exosomes e la cattura del fascio laser diffusa utilizzando un filtro precedente davanti al rivelatore. In questo modo sottopopolazioni exosome si distinguono in base alla loro antigeni di superficie e altre caratteristiche biologicamente rilevanti tecnicamente accessibili a una colorazione fluorescente selettiva.

Uno svantaggio della versione corrente del nostro strumento di monitoraggio delle particelle è il fatto che a livelli molto elevati di sensibilità manufatti come rumore di fondo possono diventare presente, che si basa sulla parete di canale della cella. Una soluzione tecnica e miglioramento del sistema attuale possono essere disponibili in un prossimo futuro. Con questo metodo le riflessioni della luce dispersione laser sulla parete del canale sarà ridotto, aumentando così la precisione dei segnali misurati ei dati ottenuti e l'abbassamento del limite di rilevabilità.

Sebbene il protocollo attualmente utilizzato per l'isolamento exosome è ben consolidata e lo strumento particle tracking applicato ha una risoluzione notevolmente preciso con una distribuzione di dimensione inferiore a 30 nm, non c'è garanzia che le particelle rilevate sono infatti del tutto veri exosomes. Altre particelle, come frammenti di cellule morte o grandi complessi proteici possono anche essere presenti nella sospensione exosome e portare a segnali falsi positivi. Un metodo affidabile per cui tale "inquinamento" può essere escluso può essere microscopia elettronica (EM), sia EM trasmissione o scansione EM. Purtroppo, nessun indicatore generale e specifico per esosomi è stato identificato finora, anche se un certo numero di marcatori di superficie proposti in precedenza hanno acquisito una crescente quantità di attenzione, tra cui tetraspanine (tspan), CD81, C63, CD9, ecc ^11.

"> A prescindere dal futuro progresso della ricerca sulla biologia exosome, soprattutto per quanto riguarda gli indicatori specifici exosome, il protocollo che viene qui presentata fornisce un potente metodo per l'isolamento e la rilevazione di esosomi. Concentrazione e dimensioni possono essere facilmente determinato in un assistito software- modo semplice. L'aggiunta di marcatori fluorescenti selettivi o anticorpi fluoroforo accoppiato probabilmente migliorare ulteriormente le possibili applicazioni del metodo presentato di NTA.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Citrate tube	BD	364305	BD Vacutainer
Distilled water	Braun	3880087	Aqua ad iniectabilia
Falcon tube	Greiner Bio One	188271	PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugation tube	Beckman	357448	Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead	Polysciences, Inc.	07304	2.6% Solids-Latex Alignment Solution
Syringe (Filter)	Braun	4617053V	5 ml
Syringe (ZetaView)	Braun	4606051V	5 ml
Needle	BD	305180	BD Blunt Fill Needle
Filter	Sartorius Stedim	16555	Syringe filter, hydrophilic, 450 µm
Ultracentrifuge	Beckman	L8-M	Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type 101
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Rotor: A-4-44