جمع وتحليل<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت

Summary

المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر.

Abstract

اللحاء المصنع هو ضروري لنقل لمسافات طويلة من (الصور) تستوعب وكذلك من الإشارات نقل الإجهاد الحيوية أو غير الحيوية. أنه يحتوي على السكريات والأحماض الأمينية والبروتينات والحمض النووي الريبي، والدهون والأيض الأخرى. بينما هناك اهتمام كبير في فهم تركيبة ووظيفة اللحاء، ودور كثير من هذه الجزيئات، وبالتالي، أهميتها في تطوير المصنع والإجهاد استجابة لديه لم يتحدد بعد. واحد عائقا أمام تحليل اللحاء تكمن في حقيقة أن الأختام اللحاء نفسه على جرح. ونتيجة لذلك، فإن عدد النباتات التي يمكن الحصول عليها اللحاء SAP محدودة. أسلوب واحد الذي يسمح مجموعة من الإفرازات اللحاء من عدة أنواع النباتات دون معدات المضافة هي اللحاء جمع الافرازات EDTA التي يسهلها وصفها هنا. في حين أنه من السهل الاستخدام، وأنها لا تؤدي إلى جرح الخلايا والرعاية يجب أن يؤخذ لإزالة محتويات الخلايا التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الضوابط لإثبات نقاء الافرازاتضرورية. لأنها تحلب بدلا من التحصيل المباشر من اللحاء SAP (غير ممكن في كثير من الأنواع) يمكن أن يحدث الكمي النسبي فقط من محتوياته. وميزة هذا الأسلوب مقارنة مع الآخرين هو أنه يمكن استخدامها في العديد من الأنواع النباتية العشبية أو الخشبية (بريلا، نبات الأرابيدوبسيس، الحور، الخ) ويتطلب الحد الأدنى من المعدات والتدريب. أنه يؤدي إلى كميات كبيرة من الإفرازات معقولة التي يمكن استخدامها لتحليلها لاحقا من البروتينات، والسكريات، والدهون، والحمض النووي الريبي والفيروسات ونواتج الأيض. انها بسيطة بما فيه الكفاية أنه يمكن أن تستخدم في كل من البحث وكذلك في مختبر التدريس.

Introduction

النباتات لا يمكن أن تتحرك إلى الفرار من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، كان لديهم لتطوير آليات للكشف عن الضغوط البيئية، وانتزاع إرسال إشارة ذات الصلة في جميع أنحاء المصنع، وضبط التنمية وفقا لذلك. توجد نظم النقل اثنين لتوزيع المياه والمواد الغذائية وغيرها من المركبات (إشارات). الأول هو الخشب؛ الذي ينقل عادة الماء والمعادن تناولها من قبل الجذور في جميع أنحاء المصنع. والثاني هو اللحاء. لقد تغيرت وجهة نظر اللحاء من استيعاب نظام النقل بسيطة لقناة لRNA والبروتين، والفيروسات، والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. انها تلعب دورا هاما في استيعاب ونقل المواد الغذائية، استجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، وكذلك في نمو وتطور النبات. ويطلق الآن عليها اسم "طريق المعلومات السريع" من النبات ^18.

ويتكون اللحاء من عدة أنواع من الخلايا: لحمة اللحاء، وكذلك رفيق المتخصصة CELLS وعناصر غربال. العنصر غربال هو موقع الحركة لمسافات طويلة. للسماح لتدفق طولية دون عائق، وعناصر غربال مفقودة معظم العضيات وكذلك النوى والتي يعتقد أنها تحتوي في أحسن الأحوال محدودة الآلات متعدية ^{21، 33.} ويعتقد أن الخلايا رفيق تجميع البروتينات وغيرها من المركبات التي تسافر في تيار اللحاء. ثم يتم نقل هذه المركبات إلى عنصر غربال عبر رابطات هيولية ويمكن أن تعمل كإشارات لمسافات طويلة ^4،16.

يمكن العثور على عدة مجموعات من المركبات في الإفرازات اللحاء:

• السكريات وغالبا ما تكون المنتجات من التمثيل الضوئي ويتم نقلها على أنها "تحمل الطاقة" الجزيئات إلى أجزاء أخرى من النبات لتخزين أو لبنات البناء. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تعمل أيضا كمضاد للتجميد أو كما يشير المركبات.
• ويمكن أيضا أن تكون موجودة في البروتينات الإفرازات اللحاء. وهي تشمل الإنزيمات الأيضية ولكن أيضا قد يشير إلى وظيفة. واحد أمثلجنيه من البروتين والتي هي بمثابة إشارة التنموية هي مزهرة موضع T البروتين، وهو ما يشير إلى تحريض المزهرة وكذلك اقتطاع ورقة الموسمية في النباتات. ⁶
• الأحماض النووية موجودة في الإفرازات اللحاء في شكل مرنا، الرناوات الصغيرة ومتناهية الصغر، والرنا الفيروسي. تظهر أن تشارك إلى حد كبير في إشارة ^{27، 28، 39.} في نفس الوقت، وقد لوحظت الريباسي وtRNAs لجميع الأحماض الأمينية تقريبا في اللحاء SAP من القرعيات ^42. تظهر على أن يتم تحويلها بشكل انتقائي في النظام أنبوب غربال. وtRNAs تظهر التعديلات الضرورية نظرا لقدرته على نقل الأحماض الأمينية إلى الجهاز متعدية. حتى الآن، بدلا من المشاركة في الترجمة، ويبدو أنها تمنع هذه العملية. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تكون بمثابة مصدر سيتوكينين أو إشارة حالة التمثيل الغذائي للنبات ^42.
• تم العثور على الأحماض الدهنية، oxylipins، والدهون الأخرى أيضا في اللحاء الإفرازات ^{3، 13، 14، 23.} JasmoNIC حامض، تتحرك oxylipin من خلال اللحاء كجزء من الاستجابة للعدوى الممرض ^{22، 29، 31، 32.} في حين أن دور معظم الدهون اللحاء لا يزال غير واضح، وبعضها من المرجح أن يشير ظيفة ^4.

ويتمثل التحدي في العمل مع اللحاء النبات تكمن في قدرته على عزل نفسه عند اصابة. هناك أربعة أساليب رئيسية تستخدم لجمع الإفرازات اللحاء، ولكنها تعمل فقط في الأنواع حدد:

1) في القرعيات أنه من الممكن الحصول على كميات معقولة من اللحاء الافرازات من خلال تخفيضات للسويقات. بمجرد إزالة الانخفاض الأولي مع التلوث من الخلايا المصاب، فمن الممكن الحصول على كميات كبيرة من الذهب الخالص معقول اللحاء SAP ^{1، 15.} ومع ذلك، مع زيادة وقت جمع، هذه الافرازات يثخن، مما يجعلها غير صالحة على نحو متزايد لنهج اللوني السائل (غير منشورة). المنشورات الأخيرة تشير إلى أن تبعا للأنواع، ويستمد هذا اللحاء SAP من eitheص حزمي (FP) أو extrafascicular اللحاء (EP) والتي، في حين أنها لا تحتوي على "المحمول" اللحاء SAP من العناصر غربال (FP)، بل هو أيضا عرضة للتلوث من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخشب ^{40، 41} .

2) والنهج الثاني هو الحصول على اللحاء SAP من خلال تخفيضات الضحلة أو ثقوب في الساق أو سويقات. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح في الترمس ^{17، 25، 36} القرعيات، والكرنب napus ^12. هنا التلوث من الخلايا المصاب هو الحد الأدنى والإفرازات نقية جدا. ومع ذلك، النباتات تحتاج إلى أن تكون صحية وجيدة تسقى منذ انها صعبة للغاية لثقب انتقائي فقط العناصر غربال. إذا رصدت سفن الخشب، ويوجه كل الافرازات في مجرى الخشب. هذا يجعل طريقة غير مناسبة للنباتات مع أعناق أو سيقان هشة للغاية أو lignified للغاية.

3) stylectomy المن المن يسمح لإدراج مرود بهم في عناصر غربالن إزالة أولا بأول مع ليزر. وناضح اللحاء SAP من خلال ما تبقى من مرود ^{2، 9، 10، 35، 38.} من الناحية النظرية، أي النباتات التي يمكن أن تصاب المن يمكن استخدامها لهذا النهج. ومع ذلك، فإن معظم الدفيئة أو مديري غرفة نمو لا يعتمد استخدام الممرض. وبالإضافة إلى ذلك، المن إدخال العديد من البروتينات في اللحاء مع لعابهم ^{19، 33.} وهذا يؤدي إلى إعادة برمجة النسخي محدودة ³⁰ و لديه القدرة على تغيير التركيبة اللحاء ^26.

4) وصف الأسلوب هنا هو نضح EDTA-سهلت من اللحاء SAP. هذا الأسلوب يستخدم EDTA لمنع تسرب من اللحاء ^20. EDTA يخلب كا ^{2 +} الأيونات التي ستشارك خلاف ذلك في العمليات التي ختم اللحاء. بينما EDTA يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا ^30، وقد استخدمت عدة مجموعات هذا الأسلوب، ويلاحظ أي تأثير سلبي من تركيزات EDTA من 10 ملم إلى 20 ملم على التركيب الدقيق خلية أو على phloeم التحميل والنقل ^{5، 24.} للحد من أي تأثير ضار وكذلك التدخل من EDTA مع اللوني وهلام الكهربائي، يتم نقل النباتات الى الماء بعد 1 ساعة، ويستخدم فقط في جزء لاحق من الافرازات ^14. وهكذا، بدلا من نضح في EDTA، وexudated اللحاء في الماء (EDTA-سهلت نضح). بل هو مستقيم إلى الأمام، وانخفاض التكلفة، ومنخفضة التقنية طريقة لجمع الإفرازات اللحاء. الحصول على اللحاء SAP بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والدهون، والرنا واستخدمت بنجاح في العديد من النباتات. في حين قد تم تنفيذ كمية محدودة من التجارب في ذوات الفلقة ^11، الأسلوب يبدو أن أكثر ملاءمة لdicots (بريلا ^{17، 20،} نبات الأرابيدوبسيس ^{8، 13، 14،} الحور ^7). مجموعة من الإفرازات أن تحدث في بيئة رطبة لتجنب فقدان الإفرازات من خلال النتح. اعتمادا على النبات، الحضانة في EDTA ل1-2 ساعات هوكافية لمنع ختم العناصر اللحاء / غربال. ويمكن بعد ذلك تحدث جمع في الماء. وهذا له فائدة من منع التأثير السلبي EDTA لديه على بنية الخلية والاستقرار. كما أنه يزيل التدخل من EDTA مع طرق مثل HPLC أو SDS-الصفحة. ويرد عليه كما ينطبق على نبات الأرابيدوبسيس. للنباتات أكبر، الحضانة في EDTA والافرازات مجموعات لابد من زيادتها، ويتم تنفيذها في الأكواب بدلا من 1.7 في أنابيب رد فعل مل.

Protocol

1. إعداد النباتات

1. يمكن نبتت بذور نبات الأرابيدوبسيس مباشرة على التربة أو على لوحات MS. تنمو النباتات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع الإضاءة 12 ساعة (22 ° C يوم، 15 ° C يلة ^14). محطات المياه مرة واحدة إلى مرتين في الأسبوع. استخدام الدرج السفلي للسقي، لا محطات المياه من أعلى؛ تسمح الأدراج لتجف قبل إعادة سقي. التأكد من النباتات جيدا المائية في وقت الحصاد.

2. إعداد حلول والأطباق

1. K-EDTA ₂ الحل: إصنع ملي K-EDTA ₂ الحل الحل 100 الأوراق المالية، والتي يمكن أن تبقى في الثلاجة. في يوم جمع وتمييع الحل 04:59 (جزء واحد EDTA حل، وأربعة أجزاء من الماء) للحصول على 20 ملي K-EDTA حل _2.
2. ملء كوب أو طبق بتري (قطر 7-15 سم) في منتصف الطريق مع ملي 20 K-EDTA حل _2. إذا جمع عينات من العلاجات المختلفة (لالسابقينمراقبة وافرة والنباتات المجهدة الملح أو المورثات مختلفة)، وإعداد أطباق منفصلة لكل معاملة.
3. ملء العدد المرغوب فيه من 1.7 مل أنابيب رد فعل مع 1.4 مل من 20 ملي K-EDTA حل _2. ملء عدد متساو من أنابيب رد فعل مع 1.4 مل تعقيمها الماء منزوع الأيونات أو ميليبور.
4. وضع المناشف الورقية على مقاعد البدلاء لوضع النباتات على؛ الحصول على واحد شفرة حلاقة جديدة وضعت على قفازات.

3. جمع من اللحاء الإفرازات (كما هو مبين في المخطط الانسيابي في الشكل 1)

1. ريدة الحصاد يترك من أربع إلى ست محطات من العمر الأسبوع بالقص مع شفرة حلاقة في قاعدة قريبة سويقات إلى وسط ريدة.
2. مكان على الفور يترك في الأطباق التي تحتوي على 20 ملي K-EDTA _2. تأكد من المغمورة نهاية قطع من سويقات في الحل (الشكل 2).
3. مرة واحدة وقد تم جمع 15 ورقة (حوالي 3-4 النباتات)، كومة الأوراق بلطف على أعلى من كل هذه ر الأخرىيتم محاذاة قبعة قطع أعناق مع بعضها البعض. Recut قاعدة أعناق (حوالي 1 ملم)، ونقل على الفور الأوراق إلى واحدة من أنابيب رد فعل مع ملي 20 K-EDTA حل _2. الأوراق تناسب أسهل إذا كانت وتوالت ارتفاعا طفيفا. تجنب الضغط على الأوراق في لأن هذا قد يسبب إصابة الخلايا، وبالتالي، ويؤدي إلى جمع المحتوى الخلية ورقة.
4. اذا كانت هناك حاجة المزيد من المواد، وتغطي بلطف عينات مع منشفة ورقية مبللة. استخدام مجموعة جديدة من الأطباق إذا لجمع عينات من العلاجات أو الأنماط الجينية المختلفة.
5. مرة واحدة يتم وضع جميع العينات في أنابيب رد فعل، وجمع الإفرازات إما في الظلام أو في الضوء.
6. لجمع في الظلام، خط الكلمة من طبق ضحل كبير مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في طبق وإما غطاء مع مناشف ورقية مبللة أو وضعها في عودة البلاستيك الأسود مع الشقوق للتهوية. وضع الإعداد كامل في خزانة أو غرفة مظلمة.
7. لجمع في ضوء، خط الجزء السفلي من وعاء شبكي واضحة مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في حاوية وإغلاقه.
8. بعد 1 ساعة، إزالة الأوراق بلطف من الحاوية وأنابيب رد فعل ويغسل جيدا بالماء المقطر، منزوع الأيونات أو ميليبور لإزالة جميع EDTA. هذه الخطوة يخدم ثلاثة أغراض: (1) أنه يزيل EDTA إلى الضرر التقليل إلى الخلايا، (2) أنه يلغي تدخل من EDTA مع SDS-PAGE واللوني، و (3) يزيل أي المركبات التي تراكمت من قطع / التالفة الخلايا. نقل على الفور الى رد فعل أنابيب معدة تحتوي على الماء تعقيمها والعودة إلى حاويات جمع مرطب لجمع الإفرازات. في هذه المرحلة، إضافة ريبونوكلياز المانع إذا احتاج الافرازات لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. اختياري: يمكن إضافة مثبطات بروتين إذا كان المطلوب تحليل البروتين.
9. بعد وقت جمع المقصود، سحب وDISCAطريق الأوراق واللحاء تجميد الإفرازات في السائل N ₂ لاستخدامها مرة أخرى. اذا كانت هناك حاجة التخزين الموسعة، يجفد العينات وتخزينها في -80 درجة مئوية.
10. في حالة نبات الأرابيدوبسيس، يمكن بالفعل يتم الكشف عن نواتج الأيض بعد مجموعة من الإفرازات لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، وجمع ل5-8 ساعة من المستحسن إذا تم التخطيط تحليل مكونات أقل وفرة. للنباتات الكبيرة مثل بريلا، ينصح مرات جمع أطول (8 ساعات).
    الافرازات التي تم جمعها من 15 ورقة هو عادة ما يكفي لحارة واحدة على SDS-PAGE هلام (البروتينات)، لاستخراج مرنا، GC-MS (السكريات ونواتج الأيض). لتحليل الدهون ويوصى تجميع عينات 2-3 (30-45 ينضح يترك) ويؤدي إلى نتائج أكثر وضوحا.

4. التحليل اللاحق (للحصول على الفيديو نظهر فقط 4.4)

1. لتحليل البروتين، عينة resuspend في 15 ميكرولتر المياه و 30 ميكرولتر العازلة Lämmli والحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور بسرعة إلى أسفل أي عrecipitates وتحميل عينة كامل الصعود إلى SDS-PAGE هلام (45 جيوب التحميل ميكرولتر). يجب أن تكون ملطخة العينات مع Coomassie صمغي أو البقع الحساسة الأخرى منذ فرة البروتين منخفض جدا.
2. بالنسبة للسكر وتحليل المستقلب صغيرة، إضافة derivatizing كلاء لالعينة المجففة كما هو موضح في الأدب ^14.
3. مرنا يمكن تحليلها باستخدام RT-PCR، ميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل.
4. لتحليل الدهون على الفور تجمع 2-3 العينات وقسم ضد الكلوروفورم: ميثانول (1:1) في غطاء الدخان كما يلي: إضافة مبلغ مساو من الكلوروفورم: ميثانول إلى كل عينة، دوامة لمدة بضع ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 400 ز س. جمع (العضوية) مرحلة القاع في أنبوب زجاجي مع غطاء تفلون وتكرار التقسيم مع مرحلة أعلى ثلاث مرات أكثر. تجفيف المراحل العضوية المشتركة تحت تيار من N ₂ وتقدم إلى مزيد من التحليل (طبقة رقيقة اللوني: TLC ^{14، 37؛} السائل اللوني الكتلة الطيفي: LC-MS ^14).

النتائج

لقد أصبح واضحا خلال السنوات القليلة الماضية أن تعقد اللحاء SAP قد يكون الجواب على السؤال عن كيفية إرسال إشارات متفاوتة النباتات التنموية والإجهاد للاستجابة المثلى. باستخدام EDTA-سهلت اللحاء نضح قد توفر فرصة لتحليل الإفرازات اللحاء من النباتات التي ليست مناسبة للمناهج أخرى ولكن قد يكون من مصلحة اقتصادية أو الفسيولوجية.

هذا الأسلوب يسمح للحصاد ما يكفي من اللحاء الإفرازات لتحديد البروتينات اللحاء المترجمة وكشف عن تغيرات في مستوياتها استجابة لتطوير أو الإجهاد (الشكل 3). كما يظهر في الشكل، هي في وفرة البروتينات منخفضة جدا، وحتى الآن، ومستوى مرتفع بما يكفي لتجارب لاحقة باستخدام البروتينات LC-MS/MS أو تحليل لطخة غربية. النتائج في القرعيات تشير إلى أن قطع من جذع يؤدي إلى اختلال التوازن إمكانات المياه وتدفق المياه واللاحقةالملوثات المحتملة من apoplast ^41. بعد جمع لمرات تتراوح 1-8 ساعات لا يؤثر على البروتين الشخصي اللحاء / تكوين في نبات الأرابيدوبسيس (. فقط المبلغ المطلق يختلف Guelette وآخرون)، وكمية البروتين التي تم جمعها وهذا النمط من البروتينات الموجودة تختلف بين الأنواع (نبات الأرابيدوبسيس: في؛ بريلا، لين أنا وNI) والعلاجات (بريلا نمت في أطوال مختلفة اليوم، لين أنا وNI). ونتيجة لذلك الإشارات البروتينية يمكن تصور، التي تم تحديدها، واتباعها.

ويمكن أيضا أن تحدد مرنا ومتناهية الصغر الرنا في الإفرازات اللحاء بواسطة هذه الطريقة. ومع ذلك، مع العلاج ريبونوكلياز المانع ضروري لمنع تدهور مرنا خلال الفترة الممتدة نضح. منذ العناصر غربال لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء وظيفية، Rubisco صغيرة أو كبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء أو RbcL، على التوالي) mRNAs ويمكن استخدام ضوابط السلبية، في حين أن المعروف اللحاءالمترجمة مرنا مثل انزيم اليوبيكويتين-التصريف يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 4).

وبالمثل، السكريات او نواتج صغيرة يمكن تحليلها باستخدام GC-MS أو LC-MS. وهنا تجدر الإشارة إلى أن الإفرازات اللحاء تحتوي على عدد كبير من الانزيمات وظيفية، بما في ذلك ما يقرب من مسار حال السكر كامل ^12. وبالتالي، وذلك باستخدام العديد من النقاط الزمنية قد تكشف عن عمليات التمثيل الغذائي خلال جمع الافرازات. ويرد مثال في الشكل (5): في جميع الإفرازات، والسكروز هو المستقلب الأكثر وفرة، وهذا هو الأكثر وضوحا بعد جمع لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، بعد خمس ساعات وانخفاض طفيف في نسبة السكروز إلى سكر الفواكه. إذا تم جمعها نفس الافرازات لمدة ساعة واحدة وترك على مقاعد البدلاء لساعات الأربع المقبلة، يتم تقليل السكروز إلى الفركتوز نسبة إلى حد أكبر من ذلك بكثير، مما يدل على أن الانزيمات النشطة في اللحاء الإفرازات تؤدي إلى تدهور السكروز في غرفة TEMاحلرارة (لمزيد من التفسيرات الذروة انظر ^14). وهذا يتفق مع النتائج التي اللحاء التحميل والنقل من الجزيئات من الخلايا رفيق في عناصر غربال قد يستمر خلال نضح حتى يفقد النظام حيويتها ^34.

نسبة الدهون في الإفرازات اللحاء، وبالتبعية، مما يشير إلى الدهون لمسافات طويلة هي مجال حديث نسبيا من الاهتمام في علوم النبات. ونظرا لنسبة الدهون في طبيعتها مسعور موجودة فقط في تركيزات منخفضة، وربما يكون منضما إلى جزيئات أخرى لالانحلالية. ومع ذلك، فإن نضح EDTA-سهلت يسمح لجمع مادة كافية لتصور (TLC؛ الشكل 6) وتحديد (LC-MS؛ الشكل 7) نسبة الدهون في اللحاء من العديد من الأنواع النباتية. كما يظهر في الشكل فمن الممكن لتحديد وفصل العديد من الأنواع الدهنية. LC-MS يسمح لتحديد الأنواع المختلفة الدهون ورصد التغيرات في ملامح من المادة الدهنية من احالمورثات NT أو العلاجات. وهذا يسمح لدراسة دور الدهون خلال تطوير المصنع والاستجابة للضغط النفسي.

الشكل 1. مخطط تدفق من مجموعة من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس أو بريلا. مسارات مختلفة تؤدي إلى منتجات نهائية مختلفة، والتي أشارت في الزرقاء. لإعداد الحمض النووي الريبي، ريبونوكلياز المانع (100 U / مل، روش) يضاف إلى الماء الذي يتم جمع الافرازات اللحاء.
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 2. إعداد المواد اللازمة لجمع اللحاء الافرازاتأيون. يعرض إعداد جميع المواد اللازمة لخطوات بروتوكول 3،1-3،4.
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 3 البروتينات الموجودة في اللحاء الإفرازات اثنين من الأنواع المختلفة النبات، نبات الأرابيدوبسيس (في) وبريلا (أنا وNI؛ أطوال اليوم مختلفة)؛ MW: الجزيئية علامة الوزن (حارة 2). تم فصل البروتينات باستخدام التدرج 10-20٪ SDS-PAGE.
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 4. تحليلوجود مرنا لRubisco الصغيرة والكبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء وRbcL، على التوالي) وانزيم اليوبيكويتين-التصريف (UBC). وقد تم جمع مرنا من أوراق نبات الأرابيدوبسيس (L)، أعناق (P)، والإفرازات اللحاء (PH)، عكس النصوص المحولة ومحددة تصور باستخدام PCR. تم تعديل الرقم من Guelette وآخرون ^14.
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل (5). الشخصي GC-MS من اللحاء الإفرازات التي تم جمعها لكمية مختلفة من الأوقات. لاحظ كيف أن الكمية النسبية للتغيرات السكروز من المجموعة رقم 1 ساعة (A) إلى 5 ساعات من وقت جمع (B). الافرازات الشخصي بعد جمع لمدة 1 ساعة تليها "الحضانة" في غرفة درجة الحرارة (RT) لمدة أربع ساعات (C). أوراق الملف الشخصي الأيض (D).
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل (6). طبقة رقيقة اللوني مقارنة الدهون من بريلا (يسار) ونبات الأرابيدوبسيس أوراق (يمين) والإفرازات اللحاء. العلامات النجمية تشير الدهون محددة لالإفرازات اللحاء. DGDG: digalactosyldiacylglycerol؛ PG: phosphatidylglycerol؛ MGDG: monogalactosyldiacyglycerol، وجزء من شخصية عرض الدهون نبات الأرابيدوبسيس تم تعديل من Guelette وآخرون ^14.
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

NT "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
الرقم 7. صورة دهن من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس (كلوروفورم المرحلة) باستخدام LC-MS / وضع الأيونات السالبة. الرسوم البيانية في الجزء العلوي (متحولة، A) وأسفل (من النوع البري، B) تظهر الاختلافات في ملامح من المادة الدهنية بين اثنين من المورثات مختلفة (يشار إليه السهام).
انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

جمع EDTA-سهلت من اللحاء الإفرازات بسيطة جدا، ويحتاج الحد الأدنى من المعدات، وينطبق على معظم النباتات. وعموما، هذا الأسلوب يمتد القدرة على تحليل الإفرازات اللحاء من أكثر الأنواع. على الرغم من أن الافرازات غير المخفف، فمن السهل أن جمع العديد من عينات مختلفة أو من العديد من النباتات لزيادة لكمية كبيرة من المواد. هذا ثم يسمح للكشف عن المركبات الرواية التي هي في وفرة منخفضة جدا وولاها يمكن تجاهلها.

هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع النباتات متعددة ويعمل كما هو موضح لتلك المذكورة في هذه المخطوطة. إذا يتم استكشاف أنواع جديدة، واثنين من الجوانب التي قد تحتاج إلى تعديل هي عدد الأوراق المستخدمة والوقت من نضح. في معظم الحالات، ينبغي أن يكون نضح 5-8 ساعة مناسبة. للتأكد من استخدام هذه الطريقة للحصول على الأنواع النباتية الجديدة، الافرازات يحتاج إلى جمع واحد أو أكثر من تحليل لاحقة كما هو موضح في البروتوكول جزء 4 نeeds التي يتعين القيام بها. اعتمادا على شدة إشارة لوحظ، قد تحتاج إلى جمع حجم زيادتها. بشكل عام، سوف الدهون والبروتين تحليل تتطلب المزيد من المواد من السكر والأيض تحليل منذ السابق هي أقل وفرة في الإفرازات اللحاء.

لأن جمع الافرازات EDTA-سهلت ينطوي على السطوح قطع فضلا عن تأثير المدمر المحتمل لEDTA، عدة نقاط يجب النظر فيها: (1) بعد الحضانة ساعة واحدة مع EDTA، وأعناق يجب غسلها جيدا. هذا يزيل أي المركبات التي تم الحصول عليها من خلايا الجرحى فضلا عن EDTA نفسها، والتي يمكن أن تضر خلايا أو تتداخل مع الاستخراج. (2) بحاجة الضوابط الإيجابية والسلبية التي ستدرج لضمان وتستمد البيانات التي تم الحصول عليها من اللحاء SAP وليس من خلايا المصاب (انظر الخطوات الحاسمة أدناه). (3) اللحاء SAP لا تحتوي على العديد من الإنزيمات، والتي يمكن أن تكون نشطة خلال جمع الافرازات. وبالتالي، في بعض الحالات، قد يكون من المفيد جمع FOR كميات مختلفة من الوقت. (4) منذ الأسلوب تشارك نضح في الماء، وهو الكمي المطلق من المركبات غير ممكن.

الخطوات الحاسمة: إن مفتاح نجاح استخدام هذا الأسلوب هو استخدام الحذر أثناء التعامل مع العينة أن لا تجرح أي الخلايا وكذلك استخدام الضوابط المناسبة (انظر المرجع ^14). واحد للتحكم مناسبة هو مجموعة من الإفرازات اللحاء دون معالجة مسبقة مع EDTA. في هذه الحالة سوف اللحاء عزل نفسه ويمكن جمع أي الافرازات. سوف يتم الكشف عن أي تلويث المركبات القادمة من خلايا الجرحى هنا. ومن شأن التحكم الثاني يكون تحليل السكريات في الافرازات. في نبات الأرابيدوبسيس، ينبغي أن يكون السكروز السائد الأيض داخل اللحاء SAP، مع الفركتوز إلى نسبة السكروز من 1:04 حتي 01:08 (المرجع ^{8، 14).}

لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مثبط ريبونوكلياز هو ضروري. وبالإضافة إلى ذلك، تحكم إيجابية من describ سابقاإد مرنا اللحاء المترجمة (UBC9: اليوبيكويتين انزيم التصريف 9، ^{At4g27960، 8، 14)} والسيطرة السلبية من على سبيل المثال مرنا بلاستيدات الخضراء (Rubisco LSU) هي الأفضل.

لأن الافرازات تحتوي على خمائر نشطة، وينصح دورة الوقت لإجراء تغييرات في التشكيل الجانبي متأكد من اللحاء ليست ببساطة بسبب الاختلافات في وقت جمع. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام مثبطات بروتين. ومع ذلك، فإن المحققين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، أن الافرازات التي تم جمعها سوف تتركز والتي سوف تتركز إلى حد كبير أي مركبات المضافة. والخطوة الثانية الحاسمة ضمن البروتوكول هو recutting من سويقات تحت EDTA. هذه الخطوة تخدم غرضا مزدوجا: أولا، أنه يزيل أي لوحات غربال مختومة في حين منع تشكيل جديد المقابس وبالتالي السماح للتدفق الحر للاللحاء SAP. الثاني، فإنه يزيل فقاعة التجويف في الخشب ولدت في حين خفض وبالتالي يسمح للنقل الخشب. حجم الخفض الثاني تعتمدق على النباتات المستخدمة. في النباتات مع أعناق أكبر ينبغي أن يكون عدة مليمترات (ما يصل إلى 1 سم) فوق قطع الأول، في النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس، مم 1-2 تكفي.

ويمكن استخدام هذه الطريقة تؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة في الإفرازات اللحاء التي كان يمكن أن يشير، والآثار التنموية أو الطب الحيوي. وقد دفع ذلك أكثر نظرة متعمقة في إشارة الدهون لمسافات طويلة، والذي كان حقل القليل المدروسة ضمن علوم النبات ويرجع ذلك إلى عدم الوصول إلى اللحاء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)	PYREX or Corning		Any clean, shallow dish will work
Chloroform	EMD	CX1054-1	Only open containers in fume hood
Methanol	J.T.Baker	9070-03
Screw cap tubes	VWR International	53283-800
Screw cap tubes	Sun Sri	13-425
Eppendorf tubes	Denville	C2170